バイオブリック

バイオブリックパーツは、制限酵素アセンブリ標準に準拠したDNA配列です。^{[1] [2]}これらのビルディングブロックは、定義された機能を持つ個々のパーツやパーツの組み合わせから、より大きな合成生物学的回路を設計および組み立てるために使用され、その後、大腸菌細胞などの生きた細胞に組み込まれて新しい生物学的システムが構築されます。^{[3]バイオブリックパーツの例には、}プロモーター、リボソーム結合部位（RBS）、コーディング配列、ターミネーターなどがあります。

BioBrick パーツは、抽象化とモジュール化のエンジニアリング原理を適用して使用されます。BioBrick パーツは、合成生物学の基盤となる階層システムの基盤を形成します。階層には 3 つのレベルがあります。

1. パーツ: 機能単位を形成する DNA の断片 (プロモーター、RBS など)
2. デバイス: 定義された機能を持つパーツのコレクション セット。簡単に言えば、補完的な BioBrick パーツのセットを組み合わせてデバイスを形成します。
3. システム: 高度なタスクを実行する一連のデバイスの組み合わせ。

標準化された生物学的部品の開発により、配列の迅速な組み立てが可能になります。個々の部品やデバイスを個別にテストして特性評価する能力により、高次システムの信頼性も向上します。^[2]

標準的な生物学的パーツのリストを作成する最初の試みは、1996年にRebatchoukらによって行われました。このチームは、短いDNA断片の組み立てにクローニング戦略を導入しました。しかし、この初期の試みは、当時の科学研究コミュニティでは広く認識されていませんでした。^{[2] [4]} 1999年、ArkinとEndyは、遺伝子回路を構成する異種要素に標準が欠けていることに気づき、標準的な生物学的パーツのリストを提案しました。^[5] BioBrickは、 2003年にMITのTom Knightによって説明され、導入されました。 ^[1]それ以来、さまざまな研究グループがBioBrickの標準パーツを利用して、新しい生物学的デバイスやシステムを設計してきました。

バイオブリック財団は、2006年にエンジニアと科学者によって、分野全体で生物学的部品を標準化するための非営利団体として設立されました。^{[6]財団は、}合成生物学に適用される技術、法律、教育、国際コミュニティの分野の改善に重点を置いています。バイオブリック財団の活動には、SBx.0会議、技術および教育プログラムの主催が含まれます。SBx.0会議は、世界中で開催される合成生物学に関する国際会議です。技術プログラムは、一連の標準的な生物学的部品の製造を目的としており、教育の拡大は、生物学的部品のオープンで標準化されたソースの作成に役立つ活動を生み出しています。^[7]

バイオブリック財団は、従来のバイオテクノロジー特許制度に代わるものとして、またバイオブリックをオープンソースコミュニティ標準として活用できるようにするために、貢献者契約とユーザー契約からなるバイオブリック公開契約を作成しました。コミュニティにパーツを提供したい人は、貢献者契約に署名し、貢献者が保有する知的財産権をユーザーに対して主張しないことに同意します。この知的財産権は、提供された素材の使用を制限する可能性があります。ユーザー契約の署名者は、貢献者から提供されたパーツのコレクション全体を自由に使用できます。パーツを使用するためにユーザーがコミュニティに貢献する必要はなく、ユーザーはパーツを使用して開発された発明に対する知的財産権を主張できます。^[8]ユーザー契約により、ユーザーはパーツの使用の発明を確立し、パーツの組み合わせに関する特許を公開し、他のユーザーの貢献を自由に構築することができます。^{[9] [10]}

BioBrickアセンブリ標準は、従来の分子クローニング方法によってもたらされた標準化の欠如を克服するために導入されました。BioBrickアセンブリ標準は、部品を組み合わせてより大きな複合材料を形成するための、より信頼性の高いアプローチです。このアセンブリ標準により、世界のさまざまな場所にいる2つの合成生物学者のグループが、設計と操作のサイクル全体を実行せずに、BioBrick部品を再利用できるようになります。^[2]つまり、新しく設計された部品を他の研究チームがより簡単に使用できます。それに加えて、旧式のアドホッククローニング方法と比較すると、アセンブリ標準プロセスはより高速で、自動化を促進します。^[11] BioBrickアセンブリ標準10は、導入された最初のアセンブリ標準でした。長年にわたり、Biofusion標準やFreiburg標準など、他のいくつかのアセンブリ標準が開発されました。

アセンブリ標準 10 は、トム ナイトによって開発され、最も広く使用されているアセンブリ標準です。これには制限酵素の使用が含まれます。すべての BioBrick パーツは、ベクターとして機能する環状プラスミドによって運ばれる DNA 配列です。^[12]ベクターは、BioBrick パーツを運ぶ輸送システムとして機能します。BioBrick 標準に向けた最初のアプローチは、それぞれ DNA パーツの5 ' 末端と 3 '末端に隣接するプレフィックス配列とサフィックス配列という標準配列の導入でした。 ^[13]これらの標準配列は、特定の制限酵素部位をコードします。プレフィックス配列はEcoRI (E) およびXbal (X) 部位をコードし、サフィックス配列はSpeI (S) およびPstI (P) 部位をコードします。プレフィックスとサフィックスは、BioBrick パーツの一部とは見なされません。^[3]アセンブリ プロセスを容易にするために、BioBrick パーツ自体にはこれらの制限部位が含まれていてはなりません。 2つの異なるパーツを組み立てる際、プラスミドの1つはEcoRIとSpeIで消化されます。もう一方のBioBrickパーツを運ぶプラスミドはEcoRIとXbalで消化されます。これにより、両方のプラスミドの5 '末端と3 '末端に4塩基対（bp）のオーバーハングが残ります。EcoRI部位は互いに相補的であるため、ライゲーションします。消化により互換性のある末端が生成されるため、 XbalとSpeI部位もライゲーションします。これで、両方のDNAパーツが1つのプラスミドに収まりました。ライゲーションにより、2つのBioBrickパーツの間に8塩基対の「傷跡」部位が生成されます。傷跡部位はXbal部位とSpeI部位のハイブリッドであるため、どちらの制限酵素でも認識されません。^[13]この消化とライゲーションのプロセスでは、プレフィックスとサフィックスの配列は変更されず、これにより、より多くのBioBrickパーツを使用した後続の組み立てステップが可能になります。

このアセンブリはべき等的なプロセスです。つまり、複数のアプリケーションで最終製品が変わることはなく、プレフィックスとサフィックスが維持されます。BioBrick 標準アセンブリでは機能モジュールの形成が可能ですが、この標準 10 アプローチには制限があります。8 bp の瘢痕部位では融合タンパク質を作成できません。^[12]瘢痕部位はフレームシフトを引き起こし、融合タンパク質の形成に必要なコドンの連続読み取りを妨げます。

トム・ナイトはその後、タンパク質ドメインの傷跡を結合する際の問題に対処するため、2008年にBB-2アセンブリ標準を開発しました。傷跡は8つの塩基で構成されており、タンパク質ドメインを結合すると読み取りフレームが変更されます。最初の部分の消化に使用される酵素はほぼ同じですが、接頭辞と接尾辞が変更されています。^[14]

BglBrick アセンブリ標準は、J. Christopher Anderson、John E. Dueber、Mariana Leguia、Gabriel C. Wu、Jonathan C. Goler、Adam P. Arkin、および Jay D. Keasling によって 2009 年 9 月に提案されました。概念は BioBrick と非常に似ていますが、読み取りフレームを変更したり停止コドンを導入したりすることなく、比較的中立的なアミノ酸リンカー スカー (GlySer) を作成しながら融合タンパク質を生成できる標準です。BglBrick 部分は、5 ′ EcoRI および BglII サイト (GAATTCaaaA GATCT ) と 3 ′ BamHI および XhoI サイト ( G GATCCaaaCTCGAG) に挟まれた DNA 配列であり、内部にはこれらの同じ制限部位がありません。ペアワイズ アセンブリの上流部分は EcoRI/BamHI 消化物から精製され、下流部分 + ベクターは EcoRI/BglII 消化物から精製されます。これら2つの断片を連結すると、パーツ定義に必要な元々の隣接部位を再形成し、パーツの接合部にGGATCT瘢痕配列を残す複合パーツが作成されます。この瘢痕は、CDSパーツをフレーム内で融合する際にアミノ酸のグリシンとセリンをエンコードします。これは、GlySerジペプチドがタンパク質ドメインの一般的なリンカーであるため便利です。^[2]

パム・シルバーの研究室は、融合タンパク質の形成をめぐる問題を克服するためにシルバーアセンブリ標準を作成しました。このアセンブリ標準はバイオフュージョン標準とも呼ばれ、バイオブリックアセンブリ標準10の改良版です。シルバーの標準では、XbalおよびSpeI部位から1ヌクレオチドを削除し、瘢痕部位を2ヌクレオチド短縮して、6 bpの瘢痕配列を形成します。6 bpの配列により、読み取りフレームを維持できます。瘢痕配列は、アミノ酸のスレオニン（ACT）とアルギニン（AGA）をコードします。^{[15]この小さな改良により、フレーム内の融合タンパク質の形成が可能になります。ただし、アルギニンは大きく荷電した}アミノ酸 であるため、バイオフュージョンアセンブリ技術には不利です。アルギニンのこれらの特性により、N末端ルールによってタンパク質が不安定になります。

2007年のフライブルクiGEMチーム^[16]は、既存のバイオフュージョン標準技術の欠点を克服するために新しいアセンブリ標準を導入しました。フライブルクチームは、既存のプレフィックスとサフィックスにそれぞれAgeIとNgoMIVという追加の制限酵素部位を導入することで、プレフィックスとサフィックスの新しい配列セットを作成しました。これらの新しく導入された制限酵素部位は、バイオブリック標準と互換性があります。フライブルク標準は依然として6bpの瘢痕部位を形成しますが、瘢痕配列（ACCGGC）は現在、それぞれスレオニンとグリシンをコードしています。この瘢痕配列により、はるかに安定したタンパク質が得られます^[17]。これは、N末端分解のシグナルとなるアルギニンとは異なり、グリシンが安定したN末端を形成するためです。フライブルクチームによって提案されたアセンブリ技術は、バイオフュージョン標準の制限を軽減します。

BioBrick の組み立てにはさまざまな方法が使用されます。これは、一部の標準では異なる材料と方法 (異なる制限酵素の使用) が必要なためです。また、一部の組み立て方法は効率が高く、ユーザーフレンドリーであるため、プロトコルの好みによるものもあります。

3A アセンブリ法は、アセンブリ標準 10、シルバー標準、フライブルク標準と互換性があるため、最も一般的に使用されています。このアセンブリ法には、2 つの BioBrick パーツとデスティネーション プラスミドが含まれます。デスティネーション プラスミドには毒性 (致死性) 遺伝子が含まれており、正しくアセンブルされたプラスミドの選択が容易になります。デスティネーション プラスミドには、BioBrick パーツを含むプラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子もあります。3 つのプラスミドはすべて適切な制限酵素で消化され、その後連結されます。正しくアセンブルされたパーツのみが、デスティネーション プラスミドに含まれる有効な複合パーツを生成します。これにより、正しくアセンブルされた BioBrick パーツのみが生き残るため、適切な選択が可能になります。

増幅インサートアセンブリ法は、プレフィックスとサフィックスの配列に依存せず、アセンブリ標準の大部分と組み合わせて使用​​できます。また、3Aアセンブリよりも形質転換率が高く、関与するプラスミドが異なる抗生物質耐性遺伝子を持つ必要もありません。この方法では、消化前にPCRを使用して目的のインサートを増幅し、メチル化DNAのようなプラスミドを消化する制限酵素DpnIで混合物を処理することで、切断されていないプラスミドからのノイズを減らします。DpnIでテンプレートプラスミドを除去すると、PCRで増幅するインサートのみが残ります。インサートとバックボーンの望ましくない組み合わせを持つプラスミドが作成される可能性を減らすために、バックボーンをホスファターゼで処理して再結合を防ぐことができます。^[14]

ギブソンの傷跡のない組み立て法では、複数のバイオブリックを同時に結合することができます。この方法では、目的の配列が 20 ～ 150 bpsの重複を持っている必要があります。バイオブリックにはこの重複がないため、この方法では、隣接するバイオブリック間にオーバーハングを作成するために PCR プライマーが必要です。T5 エキソヌクレアーゼは配列の 5 '末端を攻撃し、さまざまなコンポーネントがアニールするように設計されたすべての配列の末端に一本鎖 DNA を作成します。次に、DNA ポリメラーゼがアニールコンポーネントのギャップに DNA 部分を追加し、Taq リガーゼが最終的な鎖をシールします。^[14]

4R/2Mアセンブリ法は、既存のプラスミド（PCRやサブクローニングなし）内のパーツ（バイオブリックアセンブリスタンダード10またはシルバースタンダード）を組み合わせるために設計されました。プラスミドは、配列特異的DNAメチルトランスフェラーゼと生体内で反応し、それぞれが修飾され、後で不要な環状ライゲーション産物を線状化するために使用される2つの制限エンドヌクレアーゼのいずれかから保護されます。^[18]

バイオブリックと国際遺伝子工学機械（iGEM）コンペティションを開発したトム・ナイト率いるMITグループは、標準生物学的部品レジストリ（レジストリ）の先駆者でもあります。^[19]レジストリは合成生物学の基盤の1つであり、20,000を超えるバイオブリック部品に関するWebベースの情報とデータを提供します。レジストリには以下が含まれます。

• すべての部品、デバイス、システムの情報と特性データ
• 各部品の機能、性能、デザインを説明したカタログが含まれています

すべてのバイオブリックパーツには固有の識別コードが付いており、目的のバイオブリックパーツの検索が容易になります（例：構成的プロモーターであるBBa_J23100）。^[2]レジストリはオープンアクセスなので、誰でもバイオブリックパーツを提出できます。バイオブリックパーツの提出のほとんどは、毎年夏に開催されるiGEMコンテストに参加する学生からのものです。^[20]レジストリではデータや資料をオンラインで交換できるため、参加コミュニティによるパーツの迅速な再利用や変更が可能です。

専門的な部品レジストリも開発されています。バイオブリック部品のほとんどはiGEMコンテストの一環として学部生によって提出されるため、機能コンポーネントの設計とモデル化に不可欠な重要な特性データとメタデータが欠けている可能性があります。^[19]専門的な部品レジストリの一例として、米国を拠点とする公的資金による施設であるInternational Open Facility Advancing Biotechnology (BIOFAB) が挙げられます。この施設には、各生物学的部品の詳細な説明が含まれています。これはオープンソースのレジストリでもあり、市販されています。BIOFABは、プロの合成生物学コミュニティのニーズに対応するために、高品質のバイオブリック部品をカタログ化することを目的としています。

バイオブリック財団（BBF）は、iGEMコンペティションを超えた規模で標準化されたバイオブリック部品の使用を促進するために設立された公益団体です。BBFは現在、誰もが自由に利用できる高品質のバイオブリック部品の生産を促進するための標準フレームワークの導出に取り組んでいます。^[21]

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• 標準生物部位登録