Loading article…
MTTアッセイは、細胞の代謝活性を評価するための比色アッセイです。[1] [2] NAD(P)H 依存性細胞酸化還元酵素は、特定の条件下では、存在する生存細胞の数を反映する場合があります。これらの酵素は、化学的には 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物であるテトラゾリウム染料 MTT を、紫色の不溶性ホルマザンに還元できます。XTT、MTS、WSTなどの他の密接に関連するテトラゾリウム染料は、中間電子受容体である 1-メトキシフェナジンメト硫酸塩 (PMS) と組み合わせて使用されます。細胞不透過性の WST-1 では、還元は細胞膜電子伝達を介して細胞外で行われます。[3]しかし、この伝統的に想定されていた説明は、酸化還元酵素の明らかな関与なしに脂質細胞構造内でMTTがフォルマザンに還元される証拠も見つかっているため、現在では議論の的となっている。[4]
テトラゾリウム色素アッセイは、潜在的な医薬品や毒性物質の細胞毒性（生存細胞の損失）や細胞増殖抑制活性（増殖から静止への移行）を測定するためにも使用できます。MTTアッセイは、MTT試薬が光に敏感であるため、通常は暗闇で行われます。[5] [6] [7]
MTTおよび関連テトラゾリウム塩
黄色のテトラゾールであるMTTは、生きた細胞内で紫色の ホルマザンに還元されます。 [8]可溶化溶液（通常はジメチルスルホキシド、酸性エタノール溶液、または洗剤 のドデシル硫酸ナトリウムの希塩酸溶液 ）を加えると、不溶性の紫色のホルマザン生成物が着色溶液に溶解します。この着色溶液の吸光度は、分光光度計で特定の波長（通常は500～600 nm）を測定することで定量化できます。光の吸収の程度は、細胞内および細胞表面に蓄積されたホルマザンの濃度に依存します。ホルマザンの濃度が高いほど、紫色が濃くなり、吸光度が高くなります。
XTT（2,3-ビス-（2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド）はMTTの代替として提案されており、より高い感度と広いダイナミックレンジが得られる。生成されたフォルマザン色素は水溶性であるため、最終的な可溶化ステップを回避できる。[9]
水溶性テトラゾリウム塩は、MTT のより最近の代替品です。テトラゾリウム塩のフェニル環に正または負の電荷とヒドロキシ基を導入することによって開発されました。または、フェニル環に直接的または間接的にスルホン酸基を追加することでより優れた結果が得られました。
MTS (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)は、フェナジンメトサルフェート ( PMS )の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水中で490 nmに吸光度最大を示すホルマザン生成物を生成します。MTSアッセイは、しばしば「ワンステップ」MTTアッセイと呼ばれ、MTTアッセイで必要な断続的なステップを経ずに試薬を細胞培養物に直接添加できるという利便性を提供します。しかし、この利便性により、MTTアッセイの断続的なステップで微量の有色化合物が除去されるのに対し、ワンステップMTSアッセイではこれらの化合物がマイクロタイタープレートに残るため、MTSアッセイは比色干渉の影響を受けやすくなります。このアッセイを使用する場合は正確性を確保するために予防措置が必要であり、顕微鏡下での定性的な観察を使用してMTSの結果を確認すべきという強い議論があります。 （ただし、これはすべての比色分析において賢明なことである。）[10]
WST（水溶性テトラゾリウム塩）は、MTTアッセイ用の他の水溶性色素のシリーズであり、形成されたフォルマザンの異なる吸収スペクトルを与えるために開発されました。[11] WST-1、特にWST-8（2-（2-メトキシ-4-ニトロフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-（2,4-ジスルホフェニル）-2H-テトラゾリウム）は、細胞外で還元され、PMS電子メディエーターと結合して水溶性フォルマザンを生成するという点で、MTTよりも優れています。最後に、WSTアッセイは、（1）直接読み取ることができ（可溶化ステップを必要とするMTTとは異なり）、（2）MTTよりも効果的なシグナルを与え、（3）細胞への毒性を低下させます（細胞透過性のMTTや、細胞内に蓄積する不溶性のフォルマザンとは異なります）。[11]
意義
テトラゾリウム色素の還元は、一般に、細胞の細胞質区画におけるNAD(P)H依存性酸化還元酵素に大きく依存していると考えられている。[3] [12] そのため、MTTおよびその他のテトラゾリウム色素の還元は、NAD(P)Hフラックスによる細胞代謝活性に依存する。胸腺細胞や脾臓細胞などの代謝の低い細胞は、MTTをほとんど還元しない。対照的に、急速に分裂する細胞は、MTT還元率が高い。アッセイ条件によって代謝活性が変化し、その結果、細胞生存率に影響を与えることなくテトラゾリウム色素の還元が変化する可能性があることに留意することが重要である。[13]さらに、テトラゾリウム色素の還元メカニズム、すなわち細胞内（MTT、MTS）と細胞外（WST-1）によっても、生成物の量が決まります。さらに、酵素触媒が関与せずに、脂質細胞区画/構造内でMTTが自発的に還元されることが証明されています。[4]しかしながら、この代替パラダイムの下でも、MTTアッセイは依然として細胞の還元電位（すなわち、細胞エネルギーを駆動する還元化合物の利用可能性）を評価します。[2]そのため、最終的な細胞生存率の解釈は変わりません。
3D繊維状スキャフォールド上に播種された細胞の生存率を研究する場合、スキャフォールドの厚さがMTTアッセイの結果に影響を与える可能性がある。[14]
観察
550 nmでの光学密度（OD）は、次の式を使用して生存率の結果のパーセンテージを計算するために使用されます。[15]
- 生存率 % = 100 × OD550e / OD550b
どこ：
- OD550e = 試験項目の測定された光学濃度の平均値
- OD550b = 陰性対照の測定された光学密度の平均値
参照
参考文献
- ^ Gavanji S、Bakhtari A、Famurewa AC、Othman EM（2023 年1月）。「in vitroで評価した生薬の細胞毒性活性：レビュー」。化学と生物多様性 。20 （2）：3–27。doi ：10.1002 /cbdv.202201098。PMID 36595710。S2CID 255473013 。
- ^ ab Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (2018年4月). 「細胞生物学におけるテトラゾリウム塩およびフォルマザン製品：生存率評価、蛍光イメージング、および標識の観点」(PDF) . Acta Histochemica . 120 (3): 159–167. doi :10.1016/j.acthis.2018.02.005. PMID 29496266. 2022-02-24にオリジナルからアーカイブ(PDF) 。 2020-04-15に取得。
- ^ ab Berridge MV、Herst PM 、 Tan AS ( 2005)。「細胞生物学のツールとしてのテトラゾリウム染料：細胞還元に関する新たな知見」バイオテクノロジー年次レビュー。11 : 127–152。doi :10.1016/S1387-2656(05) 11004-7。ISBN 9780444519528. PMID 16216776。
- ^ ab Stockert JC、Blázquez-Castro A、Cañete M、Horobin RW、Villanueva A (2012 年 12 月)。「細胞生存率の MTT アッセイ: フォルマザン産物の細胞内局在は脂質滴内」。Acta Histochemica。114 ( 8 ): 785–796。doi :10.1016/ j.acthis.2012.01.006。PMID 22341561 。
- ^ Sharma, Dr Rudra (2022-10-05). 「MTTアッセイによる細胞毒性試験 - 手順、分析および結果 - ACME Research Solutions」。2022年10月6日閲覧。
- ^ Müller, G.; Kramer, A. (2006). 「ポビドンヨード溶液、軟膏、またはリポソーム製剤 (Repithel<sup>®</sup>) と特定の防腐剤の in vitro 細胞毒性の比較研究」。 皮膚科学。212 ( Suppl. 1): 91–93。doi :10.1159 / 000090102。ISSN 1018-8665。PMID 16490982。S2CID 818013 。
- ^ Pintor, AVB; Queiroz, LD; Barcelos, R.; Primo, LSG; Maia, LC; Alves, GG (2020-07-27). 「根管充填材の生体適合性を評価するためのMTTとその他の細胞生存率アッセイの比較：系統的レビュー」。International Endodontic Journal。53 ( 10 ) : 1348–1373。doi : 10.1111/ iej.13353。ISSN 0143-2885。PMID 32602945。S2CID 220271896 。
- ^ Mosmann T (1983年12月). 「細胞増殖および生存のための迅速比色アッセイ：増殖および細胞毒性アッセイへの応用」. Journal of Immunological Methods . 65 (1–2): 55–63. doi :10.1016/0022-1759(83)90303-4. PMID 6606682.
- ^ 「なぜ MTT ではなく XTT を使うべきなのか」(PDF、0.1 MB) . [aniara.com] . ANIARA。2018年 4 月 6 日のオリジナルからアーカイブ(PDF) 。2010 年 11 月 19 日取得。
- ^ Cory AH、Owen TC、Barltrop JA、Cory JG (1991 年 7 月)。「培養細胞 増殖アッセイにおける水溶性テトラゾリウム/フォルマザンアッセイの使用」。Cancer Communications。3 ( 7): 207–212。doi : 10.3727 /095535491820873191。PMID 1867954 。
- ^ ab 「水溶性テトラゾリウム塩（WST）」（PDF、0.4 MB） . [interchim.com] . Interchim . 2018年12月22日時点のオリジナルよりアーカイブ（PDF） . 2013年8月12日閲覧。
- ^ Berridge MV、Tan AS (1993 年 6 月)。「3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物 (MTT) の細胞内還元の特性: 細胞内局在、基質依存性、および MTT 還元におけるミトコンドリア電子伝達の関与」。生化学および生物物理学のアーカイブ。303 (2): 474–482。doi :10.1006/abbi.1993.1311。PMID 8390225 。
- ^ Ghasemi M、Turnbull T、Sebastian S 、 Kempson I（2021年11月）。「MTTアッセイ：バルクおよび単一細胞分析における有用性、限界、落とし穴、および解釈」。International Journal of Molecular Sciences。22（23）：12827。doi ：10.3390 / ijms222312827。PMC 8657538。PMID 34884632。
- ^ Lyundup AV、Demchenko AG、Tenchurin TH、Krasheninnikov ME、Klabukov ID、Shepelev AD (2016)。「動的培養による生分解性マトリックス中の間質細胞および上皮細胞培養の播種効率の改善」。Genes to Cells。11 ( 3): 102–107。doi : 10.5281 /zenodo.1175840。ISSN 2313-1829 。
- ^ 「ISO 10993-5:2009」。ISO 。 2022年10月6日閲覧。
さらに読む
- Wilson AP (2000)。「第 7 章: 細胞毒性と生存率」。Masters JR (編)。動物細胞培養: 実践的アプローチ。第 1 巻 (第 3 版)。オックスフォード: Oxford University Press。ISBN 978-0-19-963796-6. LCCN 00026267. OCLC 43555390. 2020年4月14日時点のオリジナルよりアーカイブ。2016年9月24日閲覧。
- Bernas T、Dobrucki J (2002 年 4 月)。「ミトコンドリアおよび非ミトコンドリアによる MTT の還元: MTT と TMRE、JC-1、NAO ミトコンドリア蛍光プローブとの相互作用」。 サイトメトリー。47 ( 4): 236–242。doi : 10.1002/cyto.10080。PMID 11933013。
外部リンク
- MTTアッセイプロトコル