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| 識別子 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| エイリアス | DHX8、DDX8、HRH1、PRP22、PRPF22、DEAH ボックス ヘリカーゼ 8、Dhr2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 外部ID | オミム：600396; MGI : 1306823;ホモロジーン: 3628;ジーンカード：DHX8; OMA :DHX8 - オルソログ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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DEAHボックスヘリカーゼ8は、ヒトではDHX8遺伝子によってコードされるタンパク質である。このタンパク質はDEAHボックスポリペプチドファミリーのメンバーである。このグループの主な特徴は、保存されたモチーフDEAH（Asp - Glu - Ala - His）である。[5]広範囲のRNAヘリカーゼがこのファミリーに属している。具体的には、DHX8はスプライシングおよびスプライソソームから核外へのスプライスされたmRNAの放出の調節に関与するATP依存性RNAヘリカーゼとして機能する。 [6]発表された研究はDHX8変異の結果を示しており、そのうちのいくつかは造血などの生物学的プロセスに重要であり、いくつかの疾患に関連している。[7] [8]
構造
タンパク質DHX8は、プレmRNAスプライシングを担うスプライソソームと呼ばれるタンパク質複合体の一部です。スプライソソームには8つの主要な機能状態があり、それぞれが異なる構成と構造を持ちます。8つの状態のうち5つは構造的に特徴付けられています。[10]
DHX8には、S1 RNA結合ドメイン（DEAD/DEAHボックス）、ヘリカーゼ保存C末端ドメイン、ヘリカーゼ関連ドメイン（HA2）、オリゴヌクレオチド/オリゴ糖結合（OB）フォールドという異なるドメインがあり、それぞれが本質的に無秩序な領域で結合されています。[11]
このタンパク質には、R620やフックループ、フックターン領域など、活性に非常に重要な領域がいくつかあります。また、DHX8Δ547は、タンパク質DHX8の触媒活性コアです。これは、2つのRecAドメインとC末端WH、ラチェット様およびOBフォールドドメイン、およびN末端領域で構成されています。[9]
DHX8 構造の総重量は 156580.13 Da です。
二次構造:
- 36% らせん状: 26 本のらせんと 246 個の残基
- 16%ベータシート：29本のストランドと110個の残基。[9]
関数
DHX8は細胞核に局在し、RNAの存在によって刺激される。このタンパク質はスプライソソームの構成要素であるため、プレmRNAスプライシングに関与する。[9]スプライシングは、スプライソソーム機構によってメッセンジャーRNAの一次転写産物からエクソンを結合し、イントロン配列を除去するプロセスであり、生成されるmRNAはイントロンがなく、結合したエクソンのみで構成される。[12]スプライシングは、スプライソソーム複合体の分解と、結果として生じる成熟RNAのATP依存性核外への放出で終了する。[13]スプライソソームは、スプライシング反応を触媒し、その後成熟したmRNAを核外に放出できるようにするために構造変化を必要とする。これらの構造変化に必要なATP依存性ヘリカーゼの1つがDHX8である。さらに、DHX8はスプライスされたmRNAの核外輸送を促進する放出において重要な役割を果たしている。タンパク質の特性解析により、DHX8はアデニンに富むRNAに結合する傾向があることがわかった。この結合に続いてATP加水分解が起こり、ADPが放出される。[9]
機構
DHX8は、補酵素および酵素調節因子アデノシン5'三リン酸との選択的かつ非共有結合的な相互作用によるATP結合など、複数の分子機能を持っています。[14]また、同一のタンパク質結合（上記と同様のタイプの相互作用を他のタンパク質と生成します）、RNA結合、およびRNAヘリックスをほどく反応の触媒に基づくRNAヘリカーゼ活性もあります。[15]
ATP + H 2 O = ADP + リン酸[16]
組織分布
DHX8 タンパク質は、主に脳、特に小脳で発現しており、小脳のプルキンエ細胞に多く見られます。その他の重要な部位は前立腺と胆嚢で、これらの領域でもこのポリペプチドの発現が見られます。
DHX8タンパク質はすべての組織や臓器で顕著に発現しているわけではなく、骨髄や軟部組織（末梢神経）がその明確な例ですが、これらの組織や臓器では代表するほどの量のタンパク質が存在しません。[17]
精製とクローニング
タンパク質の生化学的特性評価のための酵素学のアッセイでは、高濃度の目的タンパク質が必要であり、精製を確実に成功させるには、そのプロトコルは効率的で、シンプルかつコスト効率に優れている必要があります。DHX8 の精製方法の 1 つの例として、 DHX8 タンパク質にグラフトされた GST-His と呼ばれるタンパク質タグを使用する方法があります。
N末端グルタチオンセファロースタグ（GST）とC末端ヒスチジンタグ（ GST-Hisとも呼ばれる）は、組換えタンパク質の小規模なアフィニティー精製を可能にする29kDaのタグです。この方法は、タンパク質の両極端を挟む2つの異なるタグに基づいています。ただし、タンパク質の生理学的特性に影響を及ぼす可能性があるため、それぞれのケースで実証的なテストが必要です。[18]
DHX8 構造は、制限酵素を使用した PCR クローニングによって生成されます。His 6 GST-DHX8Δ54 (ヘキサヒスチジン-GST) を生成するには、残基 A548 から R1220 までのコード配列を、Thermo Fisher Scientific の特定のベクター キットである「pFastBac」のバージョンに挿入します。[19] は、 N 末端 His 6 GST タグとそれに続く HRV 3C プロテアーゼ (組み換え制限グレード プロテアーゼ) 切断部位をコードするように変更されています。HRV 3C は、ネイティブ酵素と同じ切断部位を認識する、高度に精製された組み換え 6XHis 融合タンパク質です。ベクターと挿入物は両方とも、NdeIおよびEcoRI制限酵素で消化されます。
全長 DHX8 (fl-DHX8-His 6 ) および DHX8Δ547-His 6を作成するために、PCR プライマーが設計され、His 6タグが DHX8 の C 末端に融合されます。fl-DHX8 (M1 から R1220) または DHX8Δ547 (A548 から R1220) をコードする結果として得られる PCR アンプリコンは、ポリヘドリンプロモーターの下流の「pFBDM」ベクター[20]に挿入されます。ベクターとインサートの両方がBamHIおよびNotI制限酵素で消化されます。[9]
参考文献
- ^ abc GRCh38: Ensembl リリース 89: ENSG00000067596 – Ensembl、2017 年 5 月
- ^ abc GRCm38: Ensembl リリース 89: ENSMUSG00000034931 – Ensembl、2017 年 5 月
- ^ 「Human PubMed Reference:」。国立生物工学情報センター、米国国立医学図書館。
- ^ 「マウス PubMed リファレンス:」。国立生物工学情報センター、米国国立医学図書館。
- ^ 「DHX8 遺伝子 - GeneCards | DHX8 タンパク質 | DHX8 抗体」。www.genecards.org。2019年 10 月 20 日閲覧。
- ^ 「DHX8 - ATP依存性RNAヘリカーゼDHX8 - Homo sapiens (ヒト) - DHX8遺伝子とタンパク質」。UniProt 。2019年10月20日閲覧。
- ^ English MA、Lei L、Blake T、Wincovitch SM、Sood R、Azuma M、他 (2012 年 5 月)。「dhx8 変異ゼブラフィッシュにおける不完全なスプライシング、細胞分裂欠陥、造血阻害」。Developmental Dynamics。241 ( 5 ) : 879–89。doi :10.1002 / dvdy.23774。PMC 3328592。PMID 22411201。
- ^ Dziuba N、Ferguson MR、O'Brien WA、Sanchez A、Prussia AJ、McDonald NJ、他 (2012 年 10 月)。「ヒト免疫不全ウイルス 1 型の複製に必要な細胞タンパク質の同定」。AIDS研究およびヒト レトロウイルス。28 (10): 1329–39。doi :10.1089/aid.2011.0358。PMC 3448097。PMID 22404213。
- ^ abcdef PDB : 6HYU ; Felisberto-Rodrigues C、Thomas JC、McAndrew C、Le Bihan YV、Burke R、Workman P、van Montfort RL (2019年9月)。「ヒトRNAヘリカーゼDHX8の構造的および機能的特徴付けは、RNA刺激によるADP放出のメカニズムに関する洞察を提供する」。The Biochemical Journal。476 ( 18 ) : 2521–2543。doi : 10.1042/BCJ20190383。PMID 31409651。
- ^ Zhang X、Zhan X、Yan C、Zhang W 、 Liu D、Lei J、Shi Y（2019年4月）。「連結エクソンの放出前後のヒトスプライソソームの構造」。 細胞研究。29（4）：274–285。doi ：10.1038/s41422-019-0143- x。PMC 6461851。PMID 30728453。
- ^ 「タンパク質：DHX8_HUMAN（Q14562）」。InterPro。
- ^ 「mRNAスプライシング、スプライソソーム経由」。遺伝子オントロジーとGOアノテーション。欧州バイオインフォマティクス研究所（EMBL-EBI）。2019年7月21日時点のオリジナルよりアーカイブ。
- ^ 「スプライソソーム複合体の分解」。遺伝子オントロジーとGOアノテーション。欧州バイオインフォマティクス研究所（EMBL-EBI）。2019年10月22日時点のオリジナルよりアーカイブ。
- ^ 「ATP結合」。遺伝子オントロジーとGOアノテーション。欧州バイオインフォマティクス研究所（EMBL-EBI）。2017年9月27日時点のオリジナルよりアーカイブ。
- ^ 「RNAヘリカーゼ活性」。遺伝子オントロジーとGOアノテーション。欧州バイオインフォマティクス研究所（EMBL-EBI）。2019年8月14日時点のオリジナルよりアーカイブ。
- ^ 「UniProtKB - Q14562 (DHX8_HUMAN)」. UniProt .
- ^ ab 「DHX8の組織発現 - 概要 - ヒトタンパク質アトラス」www.proteinatlas.org . 2019年10月25日閲覧。
- ^ Maity R、Pauty J、Krietsch J、Buisson R、Genois MM、Masson JY (2013 年 10 月)。「GST-His 精製: 完全長精製タンパク質を生成する 2 段階アフィニティー精製プロトコル」。Journal of Visualized Experiments ( 80): e50320。doi :10.3791/50320。PMC 3964817。PMID 24193370 。
- ^ 「Bac-to-Bac Vector Kit - Thermo Fisher Scientific」www.thermofisher.com . 2019年10月24日閲覧。
- ^ 「Addgene: pFBDM」. Addgene . 2019年10月24日閲覧。