遺伝子ノックイン

分子クローニングと生物学において、遺伝子ノックイン（略称：KI）とは、遺伝子座位のDNA配列情報を1対1で置換するか、遺伝子座位内に存在しない配列情報を挿入する遺伝子工学手法を指す。 ^[1]通常、この手法はマウスで行われる。これは、このプロセスの技術がより洗練されており、マウスとヒトの間で高度な配列複雑性が共有されているためである。^[2]ノックイン技術と従来の遺伝子組み換え技術の違いは、ノックインでは特定の遺伝子座位に遺伝子が挿入されるため、「標的を絞った」挿入となる点である。これは遺伝子ノックアウトの反対である。

ノックイン技術は、病気のモデルを作成するためによく使用されます。これは、置換される天然遺伝子の発現を制御する調節機構 (プロモーターなど) の機能を科学研究者が研究するための技術です。これは、問題の生物の新しい表現型を観察することによって行われます。この場合、大きな断片を転送できるように BACとYAC が使用されます。

遺伝子ノックインは、マーティン・エバンス、オリバー・スミシーズ、マリオ・カペッキが開発したオリジナルのノックアウト技術をわずかに改変して始まった。伝統的に、ノックイン技術は標的遺伝子の置換を促進するために相同組換えに依存していたが、標的遺伝子を挿入するためにトランスポゾンを介したシステムを使用する他の方法が開発されてきた。 ^{[3]遺伝子ベクターによる}Creリコンビナーゼの発現時に切除されるloxP隣接部位の使用はその一例である。目的の改変を加えた胚性幹細胞は、その後、生存可能な胚盤胞に移植され、成熟したキメラマウスに成長し、一部の細胞は元の胚盤胞細胞の遺伝情報を持ち、他の細胞は胚性幹細胞に導入された改変を持つ。その後、キメラマウスの子孫は遺伝子ノックインを受ける。^[4]

遺伝子ノックインにより、初めて、遺伝子改変とその結果生じる表現型に関する仮説主導の研究が可能になった。例えば、ヒトのp53遺伝子の変異は、ベンゾ（a）ピレン（BaP）への曝露によって誘発され、p53遺伝子の変異コピーはマウスのゲノムに挿入される。ノックインマウスで観察された肺腫瘍は、BaPの発がん性仮説を裏付けている。^{[5]ノックイン技術の最近の進歩により}、CRISPR/Cas9システムを使用してブタに緑色蛍光タンパク質の遺伝子を挿入できるようになり、遺伝子挿入の精度と成功度が大幅に向上した。^[6] CRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックインの速度により、一部の遺伝子の両対立遺伝子改変を生成し、マウスの表現型を1世代で観察することも可能になった。これは前例のない時間枠である。^[7]

ノックイン技術は、ノックアウト技術が特定の遺伝子座の発現を阻害するためにDNA配列の一部を削除するか、無関係なDNA配列情報を挿入することを目的としている点で、ノックアウト技術とは異なります。一方、遺伝子ノックイン技術は、DNA配列情報を1対1で置き換えるか、または前記遺伝子座には存在しない配列情報を追加することによって、目的の遺伝子座を変更します。したがって、遺伝子ノックインは機能獲得変異、遺伝子ノックアウトは機能喪失変異と見なすことができますが、遺伝子ノックインでは、機能的な遺伝子座を突然変異表現型に置き換えて、何らかの機能喪失をもたらすこともあります。^[8]

遺伝子ノックイン法はこれまで成功しているため、多くの臨床応用が考えられます。ヒト免疫グロブリン遺伝子の一部をマウスにノックインすると、治療に有用なヒト化抗体を産生できることがすでに示されています。^[9]ヒトの幹細胞を改変して、特定の組織で標的遺伝子の機能を回復させることも可能になるはずです。たとえば、造血幹細胞のIL-2受容体の変異ガンマ鎖遺伝子を修正して、X連鎖性重症複合免疫不全症の患者のリンパ球の発達を回復させることが可能です。^[4]

遺伝子ノックイン技術は、ヒト疾患モデルの生成や生体内タンパク質の洞察のための強力な技術であることが証明されていますが、依然として多くの制限が存在します。これらの多くは、ノックアウト技術の制限と共有されています。まず、ノックイン遺伝子の組み合わせにより、挿入された遺伝子とその産物とゲノムの他のセクションとの相互作用が複雑化し、その結果、副作用が増加し、表現型の説明が難しくなる可能性があります。また、 ROSA26遺伝子座など、条件付き遺伝子ノックインに使用できるほど十分に特徴付けられている遺伝子座はごくわずかであるため、同じ遺伝子座でのレポーター遺伝子とトランス遺伝子の組み合わせは問題になります。遺伝子ノックインをヒト疾患モデルの生成に使用することの最大の欠点は、マウスの生理機能がヒトと同一ではなく、マウスで発現したタンパク質のヒトオルソログが、ヒト病理における遺伝子の役割を完全には反映しないことが多いことです。^{[10]これは、} CFTR遺伝子のΔF508線維症変異を持つマウスで確認されており、この遺伝子の変異はヒト集団の70％以上を占め、嚢胞性線維症を引き起こします。ΔF508 CFマウスはヒトの変異に特徴的な処理欠陥を示しますが、ヒトに見られる肺の病態生理学的変化は示さず、実質的に肺の表現型を持ちません。^[11]このような問題は、さまざまな動物モデルを使用することで改善される可能性があり、ΔF508変異の活動をよりよく説明するために豚モデル（豚の肺はヒトの肺と多くの生化学的および生理学的類似点を共有しています）が生成されました。^[12]

• 遺伝子ノックアウト
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• 分子クローニング
• プラスミド
• ベクター（分子生物学）

• 遺伝学的方法、技術、プロトコル
• MIT の Koch 総合がん研究所: ノックインとノックアウト
• UMass プロファイル研究ネットワーク ソフトウェア: 遺伝子ノックイン技術 - 研究ネットワークと専門知識マイニング ソフトウェア ツール
• http://www.transgenic.co.jp/en/products/mice-service/modified_mouse/knockin.php – 挿入ベクターの構築とマウスの繁殖のプロセスを概説しています。