テザー粒子運動

動きがビーズ主導ではなくポリマー主導となるためには、エクスカーションナンバー N _R , ^{[ 2 ] が}1 未満になる必要があることに注意する必要がある。

${\displaystyle N_{R}\equiv {\frac {r}{\sqrt {L\cdot {l_{p}/3}}}}<1}$

どこ${\displaystyle r}$はビーズの半径です。${\displaystyle L}$はポリマーの輪郭長であり、${\displaystyle l_{p}}$はポリマーの持続長（生理的条件下では50 nm）です。（ ${\displaystyle N_{R}>1}$しかし、慎重に扱うべきである。）

金属ビーズ（通常は金）は光を強く散乱させるため、非常に小さなビーズ（ 直径約40nm）でも良好な画像が得られます。しかしながら、金属ビーズは光ピンセット実験には適していません。

ポリスチレンビーズは金属ビーズよりも弱い光を散乱します（40 nmの金ビーズから得られるのと同じ強度を得るには 、ポリスチレンビーズは～125  nmである必要があります! ^{[ 3 ]}）が、光ピンセット実験と組み合わせることができるという利点があります。

蛍光体の主な利点は、励起波長と発光波長が異なるため、ダイクロイックフィルターを使用してよりクリーンな信号が得られることです。蛍光体の欠点は、光退色が生じることです。

ビーズの種類と直径（生化学マーカーについては、テザーアセンブリのセクションを参照）はすべて市販の企業によって製造されており、容易に購入できます。

チップは2枚のカバーガラスで作ることができます。片方のカバーガラスに2つの穴を開け、試薬をフローセルに注入できるようにします。スライドは汚れを取り除くために洗浄する必要があります。バス型超音波洗浄器が適しており、イソプロパノールに15分間浸せば十分です。次に、チャネルを作成します。チャネルを作成する方法の1つは、パラフィルムを中央で切断し、スライド間のスペーサーとして使用するパラフィルムのフレームを残すことです。切断したパラフィルムを挟んで、スライドを重ね合わせます。最後のステップは、チップを加熱してパラフィルムを溶かし、スライド同士を接着することです。

まず、ポリマーがガラスに付着しないようにチップを不活性化する必要があります。ブロッキング試薬は多数（BSA、α-カゼインなど）入手可能であり、特定の状況に最適なものを見つける必要があります。次に、ポリマーの一端にある抗原（ジゴキシゲニン）に結合する抗体またはその他の反応性分子（抗ジゴキシゲニンなど）で表面をコーティングする必要があります。約45分間のインキュベーションの後、余分な抗体を洗い流す必要があります。余分な抗体を洗い流した後、ポリマーをチップに注入し、ほぼ同じ時間インキュベートする必要があります。ポリマーは、両端が事前に修飾されています。一方の端にはビオチンテールがあり、もう一方の端にはジゴキシゲニンテールがあります。インキュベーション後、結合していないポリマーをセルから洗い流す必要があります。次に、抗ビオチンコーティングビーズをフローセルに注入し、約30～45分間インキュベートする必要があります。余分なビーズを洗い流す必要があります。

前述のように、画像にはビーズ自体ではなく、 PSF（点像分布関数）に従ってより大きなスポットが表示されます。さらに、カメラのピクセルサイズによって測定の解像度が低下する可能性があります。ビーズの正確な位置（端から端までのベクトルに対応）を抽出するには、スポットの中心をできるだけ正確に見つける必要があります。これは、スポット特性に基づく2つの異なる手法を使用して、高い解像度で実行できます。焦点面における光強度はエアリーディスクとして分布し、円対称性を持っています。

2次元ガウス関数はエアリーディスクの良い近似である。この関数をスポットにフィッティングすることで、パラメータを見つけることができる。${\displaystyle x_{0}}$そして$\displaystyle y_{0}}$これらは、スポットの中心座標と、端から端までのベクトル座標です。

2つ目の手法は、質量中心の定義を用いて強度中心を求めることである^{[ 4 ]}。

$\displaystyle {\vec {R}}_{cm}={\frac {1}{I_{tot}}}\cdot \sum _{k=1}^{N}I_{k}\cdot {\vec {r}}_{k}}$

どこ${\displaystyle {\vec {R}}_{cm}}$は質量中心座標です。${\displaystyle \textstyle I_{tot}}$はスポットの総強度であり、${\displaystyle \textstyle I_{k}}$そして${\displaystyle \textstyle {\vec {r}}_{k}}$これらはk番目のピクセルの強度と座標です。円対称性のため、強度の中心の座標はビーズの中心の座標になります。 どちらの手法も、ピクセルサイズよりも高い解像度で端から端までのベクトルの座標を提供します。

通常、測定中にシステム全体がドリフトします。ドリフトを補正する方法はいくつかあり、一般的に次の3つのグループに分類できます。

ブラウン運動の周波数はドリフト周波数よりもはるかに大きいため、ハイパスフィルタを使用してドリフトを除去することができます。同様の効果は、データを平滑化し、平滑化されたデータをデータから差し引くことによっても得られます（図を参照）。

フレーム内に表示されるビーズの数が少ない場合、各ビーズがランダムに動くため、各フレームにおけるビーズの位置を平均するとドリフトが得られます（クリーンなデータを得るためには、ドリフトをデータから差し引く必要があります）。

フレーム内に固定されたビーズが表示されている場合、その位置を基準として、固定ビーズの位置に基づいてデータを補正することができます。（固定ビーズを見るもう一つの利点は、その動きから測定の精度を知ることができる点です。） もちろん、複数の方法を組み合わせることも可能です。

ポリマーの端から端までのベクトルにランダムウォーク統計を当てはめるのは一般的です。 ^{[ 5 ]} 1次元の場合は正規分布が得られ、2次元の場合はレイリー分布が得られます。

${\displaystyle P_{1D}(x)dx={\sqrt {\frac {3}{4{\pi }Ll_{p}}}}\exp {\left(-{\frac {3x^{2}}{4Ll_{p}}}\right)}dx\,\,\,;\,\,\,\,\,\,P_{2D}(R)dR=2{\pi }R{\frac {3}{4{\pi }Ll_{p}}}\exp {\left(-{\frac {3R^{2}}{4Ll_{p}}}\right)}dR}$

どこ${\displaystyle L}$輪郭の長さと${\displaystyle l_{p}}$は持続長です。 時系列データを収集した後、データのヒストグラムを分布関数（1次元または2次元）にフィッティングする必要があります。ポリマーの輪郭長が既知の場合、フィッティングパラメータは持続長のみとなります。

エントロピー力により、ポリマーはフックの法則に従うバネのように振る舞う。ボルツマン分布によれば、その分布は弾性エネルギーと熱エネルギーの比の指数に比例する。

${\displaystyle P(x)\propto \exp {\left(-{\frac {{\frac {1}{2}}kx^{2}}{K_{B}T}}\right)}}$

どこ ${\displaystyle k}$はばね定数です。${\displaystyle K_{B}}$はボルツマン定数であり、${\displaystyle T}$は温度です。分布の対数を取ることで${\displaystyle P(x)}$そしてそれを放物線の形状に当てはめることで、ポリマーのばね定数を得ることができます。^{[ 6 ]}

${\displaystyle \displaystyle k=2{\alpha }K_{B}T}$

どこ${\displaystyle \alpha }$は係数です${\displaystyle x^{2}}$放物線近似から。