フィルター結合アッセイ

生化学または化学において、フィルター結合アッセイは多くのサンプルを素早く研究する簡単な方法です。 2 つの分子間の相互作用を調べる方法の 1 つは、結合定数を決定することです。結合定数は、結合していない分子と結合している分子の比率を表す数値です。 この情報により、2 つの分子間の親和性が明らかになり、任意の初期条件セットが与えられた場合の結合量を予測できます。

結合定数を測定するには、開始濃度の範囲にわたって形成される複合体の量を測定する方法を見つける必要があります。これは、蛍光タグ、またはこの場合は放射性タグを使用して種の 1 つを「ラベル付け」することで実現できます。DNA は、アデノシン三リン酸から得られる放射性リン酸の添加によって「ラベル付け」されます。

フィルター結合アッセイは、フィルターを使用して 2 つの分子 (多くの場合、タンパク質と DNA) 間の親和性を測定します。フィルターは、負に帯電したニトロセルロース紙で作られています。ほとんどのタンパク質は正味の電荷を持っているため、ニトロセルロース紙はタンパク質を固定するのに最適です。DNA はリン酸骨格のために負に帯電しており、それ自体ではニトロセルロースに「くっつく」ことはありませんが、タンパク質に結合した DNA はくっつきます。ニトロセルロースに「くっついた」DNA の正確な量は、シンチレーション カウンターを使用してフィルター上の放射能の量を測定することで定量化されます。

タンパク質と DNA は、一連のマイクロチューブで混合されます。このチューブでは、DNA の量は一定に保たれますが、タンパク質の量は徐々に増加します。これらのサンプルは平衡状態になります。平衡状態になった後、各チューブから同量のサンプルが、真空プレート (下から真空を適用して液体を下方に吸引する平らな表面) 上に並べられた小さな円形のニトロセルロース フィルターに噴出されます。すべてのタンパク質が付着しますが、DNA に結合したタンパク質のみがシンチレーション カウンターに記録されます。

これで、使用したタンパク質の濃度ごとに結合した DNA の量を表す数値が得られ、この情報を結合曲線上にプロットして結合定数を決定できます。

このアッセイはもはや広く使用されていませんが、迅速かつ簡単で、多くの情報を提供できます。たとえば、特定のタンパク質と DNA の相互作用の比較的詳細な分析に使用されます。

平衡定数を測定します。

• 標識された DNA をタンパク質とともにインキュベートします。
• システムが平衡状態に達するまで十分な時間を取ってください。
• 混合物をニトロセルロース製のフィルターディスクで濾過します。タンパク質はニトロセルロースに結合しますが、DNA は結合しません。
• フィルター上に保持される DNA は、タンパク質と相互作用しているために存在します。
• フィルターを乾かして数えます。

オフ率を測定します。

• DNA-タンパク質複合体が結合したフィルターを取ります
• フィルターをバッファーで洗浄する
• 一定時間洗浄した後、フィルター上に残っている DNA の量を定量化します。

オフレートを測定する別の方法:

• 放射性標識DNAとタンパク質を高濃度で一緒に前培養した。
• 0時間目に、混合物は希釈された
• ニトロセルロースフィルターを使用して、様々な時点でアリコートを分析