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Spot 42 ( spf ) RNA は、spf (スポット フォーティ ツー)遺伝子によってコードされる調節性の非コード細菌小型 RNAです。[ 1 ] Spfはガンマプロテオバクテリアに存在し、Spot42 に関する実験的研究の大部分は、大腸菌[ 2 ] [ 3 ]および最近ではAliivibrio salmonicida [ 4 ]で行われています。細胞内では、Spot42 は炭水化物代謝と取り込みの調節因子として重要な役割を果たし、その発現はグルコースによって活性化され、cAMP - CRP複合体によって阻害されます。[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]
sRNAは別のプロモーターから転写され、不完全な塩基対形成によってメッセンジャーRNA標的に結合する。Spot42の生体内半減期は37 ℃で12～13分である。 [ 5 ]グルコースを添加した培地で培養した場合、各細胞には100～200コピーのSpot42が含まれる。[ 7 ]しかし、細胞をコハク酸で培養した場合、またはグルコースで培養した細胞にcAMPを添加した場合、対応するレベルは3～4分の1に減少する。 [ 8 ]
Spot42は、1973年に大腸菌の109ヌクレオチドからなる不安定なRNA種として初めて記述されました。アミノ酸飢餓時の大腸菌における小型RNAの蓄積を研究する試みの中で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動と2次元フィンガープリンティングによって発見されました。[ 2 ] [ 3 ]これらの実験では、 Spot42の電気泳動移動度は5S rRNAのそれと類似していました。1979年には、Spot42はグルコース存在下での増殖（すなわち、アデノシン3',5'-環状一リン酸（cAMP）が低い場合）中に蓄積することが発見されました。グルコース以外の炭素源で増殖した場合（すなわち、cAMP濃度が高い場合）、Spot42濃度は有意に低いことがわかりました。[ 7 ]
その後の実験では、Spot42の過剰発現（約10倍の増加）により、成長が阻害され、より栄養豊富な培地への変化への適応能力が低下することが示された。[ 10 ]さらに、炭素源をグルコースからコハク酸に変更すると、長い誘導期と遅い成長速度が生じた。また、異常な反応の原因は、遺伝子自体の過剰ではなく、過剰なSpot42 RNA遺伝子産物の増加によるものであるとも述べられている。大腸菌細胞におけるspfの欠失研究では、生存可能なspfヌル変異体が得られたことから、少なくとも制御された実験室条件下では、Spot42は必須ではないことが示唆される。[ 11 ]
spf遺伝子の自然分布は、ガンマプロテオバクテリアの5つの目（腸内細菌目、アエロモナス目、ビブリオ目、アルテロモナス目、クロマチア目）に限定されている。[ 12 ]
spf遺伝子は、腸内細菌科のEscherichia、Shigella、Klebsiella、Salmonella、Yersinia属で高度に保存されている。[ 6 ]大腸菌では、 spf遺伝子はpolA（上流）とyihA （下流）に挟まれている。[ 13 ] [ 14 ] spfの上流にはCRP結合配列と-10および-35プロモーター配列が存在する。
Spfはビブリオ科内でも高度に保存されており、最近、入手可能な76のビブリオ科ゲノムすべて（例えば、ビブリオ、アリイビブリオ、フォトバクテリウム、グリモンティア属）で同定されました。[ 4 ]例えば、ビブリオ・コレラ、ビブリオ・ブルニフィカス、アリイビブリオ・フィシェリ、アリイビブリオ・サルモニシダでは、spf遺伝子はpolA（上流）と新規VSsRNA24をコードするsRNA遺伝子（下流）に挟まれています。
Spot 42 の機能が 109ヌクレオチドRNA自体を介して媒介されるのか、それともsRNA 配列内から仮説的にコードされている14アミノ酸長のペプチドを介して媒介されるのかは、数年間不明でした。これは、Spot42 が大腸菌で見られる他の非コード RNA ( 6S RNAやラムダ バクテリオファージなど) と同様の構造的特徴と、mRNA に典型的に見られる特徴 (ポリプリン配列に続いて AUG、14 アミノ酸、UGA 終結配列) を持っているという観察に基づいています。[ 1 ]フィルター結合アッセイやその他の方法を使用すると、Spot 42 は mRNA ではないことが示されました。このアプローチでは、Spot42 と70S リボソームとの親和性がテストされました。[ 15 ]ここで、Spot 42 は精製された 70S リボソームに非常に非効率的に結合し、Spot 42 の機能は RNA 自体によって媒介されるという結論に至りました。 BækkedalとHaugenは、当時（2015年）に知られていたすべての「spf」配列に基づいてSpot42のコンセンサス二次構造を作成し、Spot42遺伝子が同定された5つの目にわたって高度に保存されていることを発見した。[ 12 ]二次構造には、既知のmRNA標的との結合に関与する可能性のある高度に保存されたヌクレオチド位置がある。
大腸菌では、 Spot 42 はグルコース存在下での増殖時に蓄積します(すなわち、アデノシン 3′,5′-環状一リン酸 ( cAMP ) が低い場合)。[ 7 ] Spot 42 レベルがグルコースと cAMP に直接反応するのは、cAMP-CRP (cAMP 受容体タンパク質) 複合体によるspf発現の抑制によるものです。 [ 8 ] Spot42 は、細胞がグルコース中で増殖すると細胞あたり 100～200 コピー存在し、細胞がコハク酸(二次炭素源) 中で増殖すると 3～4 倍減少します。二次炭素源中で増殖した細胞における Spot42 の減少は、cAMP-CRP 複合体が spf プロモーターに結合し、Spot42 の転写を負に制御することによるものです。その後、 spfがpolA ( DNA ポリメラーゼ Iをコードする遺伝子)に近接していることから、Polayes らは、これらの遺伝子の産物が互いに影響し合うかどうかを検証しました。[ 13 ]彼らは、spfの欠失または成長条件の操作によってスポット42のレベルを低下させると、DNAポリメラーゼAの活性が低下することを発見した。しかし、この観察の根本的なメカニズムは依然として不明である。
Spot42は塩基対形成を介してmRNA標的と直接相互作用することができる。最初のSpot42標的はMøllerらによって発見され、Spot42がgalK（ガラクトイナーゼをコードする）の翻訳開始領域の短い相補領域に特異的に結合することが示された。 [ 6 ] galKはガラクトースオペロンの3番目の遺伝子であり、このオペロンは4つの遺伝子（ galETKM）を含み、ポリシストロン性mRNAを生成する。Spot42はgalKシャイン-ダルガノ領域に結合することでgalオペロンの不協調発現（すなわち、オペロン内の個々の遺伝子が同様に発現しない）を媒介し、それによってgalK遺伝子のリボソーム結合と翻訳を阻害する。協調発現の生理学的意義は不明であるが、Spot42が炭素源の利用を最適化するために遺伝子発現を微調整する役割を果たしていることが示唆される。
BeiselとStorzは、マイクロアレイ解析とレポーター融合を用いて、Spot 42が少なくとも14個のオペロンを制御することで代謝においてより広範な役割を果たしていることを実証した。 [ 5 ]これらのオペロンには、好ましくない炭素源の取り込みと異化に関与する多数の遺伝子が含まれている。Spot 42の過剰発現中、16個の異なる遺伝子でmRNAレベルが2倍に上昇した。同定された遺伝子は、主に中心代謝と二次代謝、好ましくない炭素源の取り込みと異化、およびNADHの酸化に関与している。
比較ゲノム解析アプローチにより、Spot 42と大腸菌TCAサイクルとの関連性が拡大した。[ 16 ]以前に報告されたTCA関連標的gltA [ 5 ]に加えて、 icdとsucCの両方が計算によって予測され、その後実験的にSpot 42の直接の標的であることが検証された。さらに、このアプローチにより、gdhAがSpot42の直接の標的であることが検出された。gdhAはグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードし、クエン酸サイクルと窒素代謝を結びつけている。
Hfqタンパク質のトランスクリプトーム全体にわたる結合マップと比較標的予測[ 17 ]を組み合わせた研究により、mglB（STM2190）mRNAがSpot42の直接の標的であることが特定されました。 [ 18 ]
A. salmonicida にはspf遺伝子 (Spot 42 をコードする)が含まれているが、 galKオペロン ( E. coliにおける Spot 42 の自然な標的) が欠如しているという観察結果から、科学者たちはこの魚病原体における Spot 42 の役割を研究するようになった。[ 4 ] A. salmonicida は最小培地でガラクトースを利用できず ( galオペロンが欠如している)、ガラクトースを添加しても成長速度にほとんど影響がない。細胞をグルコースで培養すると Spot42 のレベルは 16～40 倍に増加するが、対照的に cAMP を添加すると 3 倍に減少することから、Spot42 はおそらくE. coliと同様の役割(すなわち、炭水化物代謝) を持っていると考えられる。Spot 42 はspfの 262 nt 下流に位置するVSsrna24と呼ばれる新規 sRNA 遺伝子と協調して機能するという仮説が立てられている。 VSsrna42 RNAは長さ約60 ntで、Spot42とは逆の発現パターンを示します。さらに、spf欠損変異体では、ピリン様タンパク質をコードする遺伝子が16倍に上方制御されていました。ピリンは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1の活性を調節することで中心代謝において重要な役割を果たし、ピルビン酸が発酵されるか、TCAサイクルと電子伝達系を介した呼吸を受けるかを選択します。