多角度光散乱

多角度光散乱( MALS ) は、サンプルによって複数の角度に散乱された光を 測定する技術です。これは、光がどのように散乱するかを検出することで、溶液中の分子の絶対モル質量と平均サイズの両方を決定するために使用されます。レーザー光源からの平行ビームが最もよく使用され、その場合、この技術は多角度レーザー光散乱( MALLS )と呼ばれます。レーザーという言葉を挿入したのは、水銀アークランプなどの従来の光源を使用して光散乱測定を行ってきた人々に、低角度測定が行えるようになったことを安心させるためでした。 ^[要出典]

レーザーとそれに関連する狭い幅の細いビームが登場するまでは、このような測定を行うために使用されていた従来の光線の幅では、より小さな散乱角度でのデータ収集は不可能でした。近年、市販されているすべての光散乱機器はレーザー光源を使用しているため、光源について言及する必要はなくなり、全体的に MALS という用語が使用されています。

「マルチアングル」という用語は、たとえば、選択された特定の角度を含む範囲にわたって移動される単一の検出器、または特定の角度位置に固定された検出器の配列によって測定される、異なる離散角度での散乱光の検出を指します。この静的光散乱に関連する物理現象について、いくつかのアプリケーション、データ分析方法、および関連するグラフィック表現を含めて説明します。

照射されたサンプルからの散乱光の測定は、いわゆる古典的な光散乱測定の基礎となります。歴史的には、このような測定は、照射されたサンプルの周りを円弧状に回転する単一の検出器^{[1] [2]}を使用して行われていました。最初の市販機器 (正式には「散乱光度計」と呼ばれていました) は、1950 年代半ばに導入された Brice-Phoenix 光散乱光度計であり、1960 年代後半に導入された Sofica 光度計がそれに続きました。

測定値は一般に散乱強度または散乱放射照度として表される。データ収集は検出器をアークの異なる位置（各位置は異なる散乱角度に対応）に配置して行われたため、関心のある各角度位置に別々の検出器を配置するという概念はよく理解されていたが^[3] 、 1970 年代後半まで商業的に実装されることはなかった^{[4] 。異なる}量子効率を持つ複数の検出器は応答が異なるため、この方式では正規化する必要がある。高速フィルムを使用する興味深いシステムが、1974 年に Brunsting と Mullaney によって開発された^[5]。これにより、散乱強度の全範囲をフィルムに記録し、その後の濃度計スキャンで相対散乱強度を得ることができるようになった。当時は、特定の角度で強度が収集された照明サンプルの周りを単一の検出器が回転する方式が一般的であったが、これは量子力学用語の微分断面積 [7] σ(θ) にちなんで微分光散乱と呼ばれていた^。これは^{ミリバーン}/ステラジアンで表された。微分断面積測定は、例えば、中性子などの核子^[8]を原子核から散乱させることによって原子核の構造を研究するために一般的に行われていました。微分光散乱と動的光散乱を区別することが重要です。どちらも頭文字がDLSで呼ばれます。後者はまったく異なる技術を指し、建設的干渉と破壊的干渉による散乱光の変動を測定します。周波数は、溶液または懸濁液中の分子または粒子の 熱運動、ブラウン運動に関連しています。

MALS 測定には、一連の補助要素が必要です。その中で最も重要なのは、サンプルの領域を照らす平行または集束された光線 (通常は、単色光の平行光線を生成するレーザー光源からのもの) です。最新の機器では、光線は一般に測定面に対して垂直な平面偏光ですが、異方性粒子を研究する場合は特に他の偏光が使用されることがあります。レーザーが導入される前の初期の測定では、水銀アークランプなどの光源からの集束された非偏光光線を使用して実行されていました。^[要出典]必要なもう 1 つの要素は、測定するサンプルを保持する光学セルです。または、流動サンプルの測定を可能にする手段を組み込んだセルを使用することもできます。単一粒子の散乱特性を測定する場合は、周囲の検出器からほぼ等距離の点で、そのような粒子を 1 つずつ光線に通す手段が必要です。

MALSベースの測定のほとんどは、照射ビームが通過する中央のサンプルから等距離に配置された一連の検出器を含む平面内で実行されますが、検出器が球体の表面にあり、サンプルが球体の直径に沿って通過する入射光ビーム^の経路と交差する中心を通過するように制御される3次元バージョン[9] [10]も開発されています。前者のフレームワーク^{[ 9]}はエアロゾル粒子の測定に使用され、後者^[10]は植物プランクトンなどの海洋生物の調査に使用されました。

従来の差分光散乱測定は、現在使用されている MALS 技術と実質的に同じでした。MALS 技術は一般に、一連の個別の検出器の出力から多重化されたデータを順次収集しますが、以前の差分光散乱測定でも、単一の検出器が 1 つの収集角度から次の収集角度に移動されるにつれて、データが順次収集されていました。MALS 実装は当然はるかに高速ですが、同じ種類のデータが収集され、同じ方法で解釈されます。したがって、この 2 つの用語は同じ概念を指します。差分光散乱測定の場合、光散乱光度計には単一の検出器がありますが、MALS 光散乱光度計には通常、複数の検出器があります。

別のタイプのMALSデバイスは、1971年にGeorgeら^[12]がLitton Systems Inc.向けに発明した光パターン検出器に基づいて、 1974年にSalzmannら^{[11]によって開発されました。Litton検出器は、球面レンズの後部焦点面における光エネルギー分布をサンプリングし、フィルムトランスペアレンシーに記録された物体の幾何学的関係と}スペクトル密度分布をサンプリングするために開発されました。

Salzman らによる Litton 検出器の応用により、0° から 30° の間の 32 の小さな散乱角での測定が可能になり、静的光散乱の前方角度が最も重要な角度であるため、広範囲の方位角にわたって平均化されました。1980 年までに、Bartholi ら^[13]は、楕円反射鏡を使用して 2.5° ≤ θ ≤ 177.5° の範囲で 30 の極角を 2.1° の分解能で測定できる新しい散乱角測定方法を開発しました。

マルチアングルシステムの商業化は、1977年にサイエンススペクトラム社^[14]が米国食品医薬品局向けに開発されたカスタマイズされたバイオアッセイシステム用のフロースルーキャピラリーシステムの特許を取得したときに始まりました。8つの個別の検出器を組み込んだ最初の商用MALS機器は、1983年にワイアットテクノロジー社からSCジョンソンアンドサン社に納入され、 ^[15]続いて1984年に最初の15検出器フロー機器（Dawn-F）^[16]がAMOCO社に販売されました。1988年までには、特に単一のエアロゾル粒子の散乱特性を測定するための3次元構成が導入されました^[9]。ほぼ同じ時期に、単一の植物プランクトンの散乱光特性を測定するための水中装置が構築されました。^[10]信号は光ファイバーによって収集され、個々の光電子増倍管に送信されました。 2001 年 12 月頃、 CCD検出器を使用して 7 つの散乱角度を測定する機器が商品化されました(BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp、ニューヨーク州ホットスビル)。

MALS光度計による測定に関する文献は膨大である。^{[17] [18]}粒子/分子のバッチ測定と、サイズ排除クロマトグラフィー^[19] (SEC)、逆相クロマトグラフィー^[20] (RPC)、フィールドフローフラクショネーション^[21] (FFF)などのクロマトグラフィー手段による分画後の測定の両方について。

多角位置で行われた散乱測定の解釈は、測定された粒子または分子の事前特性に関するある程度の知識に依存します。このような散乱体のさまざまなクラスの散乱特性は、適切な理論を適用することで最もよく解釈できます。たとえば、次の理論が最もよく適用されます。

レイリー散乱は最も単純で、入射波長よりもはるかに小さい物体による光やその他の電磁放射の弾性散乱を表します。このタイプの散乱は、日中の空の青色の原因であり、波長の 4 乗に反比例します。

レイリー・ガンズ近似は、散乱粒子の屈折率n ₁が周囲の媒体の屈折率n ₀に非常に近いという仮定のもとで MALS 測定を解釈する手段です。 m = n ₁ /n ₀と設定し、 |m - 1| << 1と仮定すると、そのような粒子は非常に小さな要素で構成されているとみなされ、各要素はレイリー散乱粒子として表すことができます。したがって、大きな粒子の各小さな要素は、他の要素とは独立して散乱すると仮定されます。

ローレンツ・ミー理論^[22]は均質な球状粒子による光の散乱を解釈するために使用される。レイリー・ガンズ近似とローレンツ・ミー理論は、 |1 − m | → 0の極限において均質な球に対して同一の結果を生成する。

ローレンツ・ミー理論は、参考文献によれば球対称粒子に一般化できる可能性がある。^[23] より一般的な形状と構造はエルマによって扱われている。^[24]

散乱データは通常、いわゆる過剰レイリー比で表されます。過剰レイリー比は、溶液または単一粒子イベントのレイリー比からキャリア流体自体のレイリー比と、その他のバックグラウンド寄与（存在する場合）を差し引いた値として定義されます。角度 θ で立体角 ΔΩ を占める検出器で測定されたレイリー比は、単位立体角、単位入射強度I ₀、単位照射散乱体積ΔVあたりの光強度として定義されます。散乱光が検出器に到達する散乱体積ΔV は、通常、開口部、レンズ、および絞りによって制限される検出器の視野によって決まります。次に、レーザーによって生成された細い光線で照射された、1 ml あたり N 個の同一粒子/分子の懸濁液から平面で行われた MALS 測定を考えてみましょう。光は検出器の平面に対して垂直に偏光していると仮定します。角度θで検出器によって測定された散乱光強度が懸濁液によって散乱された強度を超過すると、次の式が成り立ちます 。

${\displaystyle I(\theta )={\frac {I_{0}N\Delta V}{(kr)^{2}}}i(\theta )}$、

ここで、i(θ)は単一粒子の散乱関数^{[1] 、} k = 2πn ₀ /λ ₀、n ₀は懸濁液の屈折率、λ _0は入射光の真空波長である。過剰レイリー比R(θ)は次のように与えられる。

${\displaystyle R(\theta )={\frac {I(\theta )r^{2}}{I_{0}\Delta V}}=Ni(\theta )/k^{2}}$。

屈折率nが懸濁流体の屈折率「n ₀」とほぼ等しい半径aの単純な均質球の場合、つまりレイリー・ガンズ近似の場合であっても、散乱面における散乱関数は比較的複雑な量である。

${\displaystyle i(\theta )={\frac {k^{2}V^{2}\left|{m-1}\right|^{2}}{4\pi ^{2}}}G^{2}\left({2ka\sin {\frac {\theta }{2}}}\right)}$、 どこ

${\displaystyle G(\xi )={\frac {3}{\xi ^{2}}}(\sin \xi -\xi \cos \xi )}$、、   ​    ${\displaystyle k={\frac {2\pi n_{0}}{\lambda _{0}}}}$${\displaystyle V={\frac {4}{3}}\pi a^{3}}$

λ _{0 は}真空中の入射光の波長です。

MALS は、溶液中の分子の質量とサイズの特性評価に最もよく使用されます。Bruno H. Zimmが論文「光散乱の角度変化の測定と解釈のための装置と方法、ポリスチレン溶液に関する予備的結果」^[1]で論じたような MALS の初期の実装では、透明容器に入れられたサンプルの周りを回転する単一の検出器が使用されていました。このような流動しないサンプルからの MALS 測定は、一般に「バッチ測定」と呼ばれます。いくつかの既知の低濃度のサンプルを作成し、さまざまな角度でサンプルの周りの散乱光を検出することにより、次をプロットして Zimm プロット^[25]を作成できます。vsここで、cはサンプルの濃度、kはkcとを同じ数値範囲に 入れるために使用される伸長係数です。${\displaystyle {\frac {K^{*}c}{R_{\theta }}}}$${\displaystyle \sin^{2}{\frac {\theta}{2}}+kc}$${\displaystyle \sin^{2}{\frac {\theta}{2}}}$

プロットすると、角度と濃度の両方がゼロになるまで外挿することができ、プロットを分析すると、c = 0ラインの初期傾斜からサンプル分子の平均二乗半径と、濃度と角度の両方がゼロになる点における分子のモル質量が得られます。収集されたすべてのデータを組み込むZimmプロットの改良（一般に「グローバルフィット」と呼ばれる）は、現代のバッチ分析ではZimmプロットに大きく取って代わっています。^[26]

サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の出現により、MALS 測定は、較正技術に頼るのではなく、カラムから溶出するサンプル画分の絶対モル質量とサイズを決定するために、オンライン濃度検出器と組み合わせて使用​​されるようになりました。これらのフローモード MALS 測定は、フィールドフローフラクショネーション、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどの他の分離技術にも拡張されています。

光散乱データの角度依存性は、SEC によって分離されたポリスチレン球の混合物の図に示されています。 2 つの最小サンプル (右端) は最後に溶出され、角度依存性は見られません。 右から 2 番目のサンプルは、低い散乱角度で強度が増加する線形角度変化を示しています。 左の最大のサンプルは最初に溶出され、非線形角度変化を示しています。

SEC などのサンプル分離手段の後に MALS をインライン濃度検出器と組み合わせると、溶出サンプルのモル質量と二乗平均平方根半径を計算できます。下の図は、BSA 凝集体のクロマトグラフィー分離を表しています。MALS 検出器からの 90° 光散乱信号と各溶出スライスのモル質量値が表示されています。

MALS は分子のモル質量とサイズを提供できるため、タンパク質間の結合、オリゴマー化、自己組織化、会合、解離の速度論を研究することができます。サンプルのモル質量をその濃度と比較することで、相互作用する分子の結合親和性と化学量論を判定できます。

ポリマーの分岐比は、ランダムに分岐したポリマーの分岐単位の数と星型分岐ポリマーの腕の数に関係し、ジムとストックマイヤーによって次のように定義されました。

${\displaystyle g={\frac {R_{b}^{2}}{R_{l}^{2}}}}$

ここで、同じモル質量を持つ分岐高分子と線状高分子の平均二乗半径は0です。^[27]上記のようにMALSを濃度検出器と組み合わせて使用​​すると、二乗平均平方根半径とモル質量の対数プロットを作成できます。このプロットの傾きから分岐比gが得られます。^[28]${\displaystyle R^{2}}$

分岐に加えて、サイズとモル質量の log-log プロットは高分子の形状または構造を示します。プロットの傾きが増加すると、ポリマーの構造が球状からランダム コイル、直線状に変化していることを示します。MALS からの平均二乗半径とDLS 測定から得られた流体力学的半径を組み合わせると、各高分子サイズ分率の形状係数 ρ = が得られます。 ${\displaystyle r_{h}}$${\displaystyle {\frac {r_{g}}{r_{h}}}}$

MALSの他の用途には、ナノ粒子のサイズ測定、^{[29] [30] [31]} タンパク質凝集研究、タンパク質間相互作用、電気泳動移動度またはゼータ電位などがあります。MALS技術は、医薬品の安定性とナノ医療での使用の研究に採用されています。