構造検証

高分子構造の検証は、タンパク質や核酸などの大きな生体分子の3次元原子モデルの信頼性を評価するプロセスです。分子内の各原子の3D座標を提供するこれらのモデル（画像の例を参照）は、X線結晶構造解析^[1]や核磁気共鳴（NMR）^[2]などの構造生物学実験から得られます。検証には、1）実験における数千から数百万の測定値の妥当性を確認すること、2）原子モデルがそれらの実験データとどの程度一致しているかを確認すること、3）モデルが既知の物理的および化学的特性と一致するかどうかを確認するという3つの側面があります。

タンパク質と核酸は生物学の主力物質であり、必要な化学反応、構造組織、成長、可動性、再生、環境感受性を提供します。それらの生物学的機能に不可欠なのは、分子の詳細な 3D 構造とそれらの構造の変化です。それらの機能を理解して制御するには、それらの構造を表すモデルについて、多くの長所と時折の弱点を含めて正確な知識が必要です。

高分子モデルのエンドユーザーには、臨床医、教師、学生のほか、構造生物学者自身、雑誌編集者や査読者、他の技術で高分子を研究する実験者、生物分子のより一般的な特性を研究する理論家やバイオインフォマティクス研究者などが含まれます。彼らの関心や要件はさまざまですが、モデルの信頼性に関する全体的および局所的な理解は、すべての人にとって大きなメリットとなります。

高分子結晶学は、より古い分野である小分子X 線結晶学(数百個未満の原子の構造) に先行していました。小分子の回折データは、高分子で実現可能な解像度よりもはるかに高い解像度にまで拡張され、データと原子モデルの間には非常に明確な数学的関係があります。残差、つまり R 係数は、実験データと原子モデルから逆算された値との一致を測定します。十分に決定された小分子構造の場合、R 係数は実験データの不確実性と同じくらい小さくなります (5% を大幅に下回ります)。したがって、その 1 つのテストだけで必要な検証の大部分が提供されますが、Acta Crystallographica セクションB や Cなどの国際結晶学連合 (IUCr) ジャーナルに投稿される小分子結晶構造論文の要件として、自動化ソフトウェア^[3]によっていくつかの追加の一貫性と方法論のチェックが行われます。これらの小分子構造の原子座標は、ケンブリッジ構造データベース(CSD) ^[4]または結晶学オープンデータベース(COD) ^[5]を通じてアーカイブされ、アクセスできます。

最初の高分子検証ソフトウェアは、1990年頃にタンパク質用に開発されました。これには、モデルとデータの一致のためのRfreeクロス検証、 ^[6] 、共有結合ジオメトリの結合長と角度のパラメーター、^[7]、側鎖とバックボーンのコンフォメーション基準が含まれていました。^{[8] [9] [10]} 高分子構造の場合、原子モデルはタンパク質データバンク（PDB）に保存されており、現在でもこのデータの唯一のアーカイブです。 PDBは1970年代にブルックヘブン国立研究所で設立され、^[11] 2000年にラトガース大学を中心とするRCSB（構造生物学研究協力機構）に移管され、^[12] 2003年にwwPDB（世界タンパク質データバンク）に拡張され、^[13]ヨーロッパ（[1]）とアジア（[2]）のアクセスサイトが追加され、NMRデータはウィスコンシン州のBioMagResBank（BMRB）で取り扱われるようになりました。

検証は急速にこの分野の標準となり、^[14]以下に述べるさらなる発展が見られました。 *明らかに拡張が必要です*

2008年2月1日、ワールドワイドタンパク質データバンク（wwPDB）が原子座標とともに実験データの登録を義務付けたことで、X線とNMRの両方に対する包括的な検証の適用性が大きく高まりました。2012年以来、X線結晶構造解析、^[15]、NMR、^[16]、SAXS（小角X線散乱）、cryoEM（クライオ電子顕微鏡）[ ¹⁷ ]のwwPDB検証タスクフォース委員会の勧告に基づいて、wwPDB登録に対する強力な検証形式が採用されつつあります。

検証は、収集された生データの検証 (データ検証)、データの原子モデルへの解釈 (モデルからデータへの検証)、そして最後にモデル自体の検証という 3 つの段階に分けられます。最初の 2 つのステップは使用する手法に固有のものですが、最終モデルにおける原子の配置の検証は固有のものではありません。

^{[7] [18] [19]}

タンパク質とRNAのバックボーンと側鎖の二面角には、許容される（または禁じられる）角度の特定の組み合わせがあることが示されています。タンパク質バックボーンの二面角（φ、ψ）については、伝説的なラマチャンドランプロットで対処されていますが、側鎖の二面角（χ）については、ダンブラックバックボーン依存ロータマーライブラリを参照する必要があります。^[20]

mRNA 構造は一般に短命で一本鎖ですが、さまざまな二次および三次フォールディング (tRNA、rRNA など) を持つ非コード RNA が豊富に存在し、それらには標準的なワトソン クリック(WC) 塩基対が多数含まれ、非ワトソン クリック (NWC) 塩基対も相当数含まれています。そのため、このような RNA は核酸ヘリックスに適用される通常の構造検証の対象にもなります。標準的な方法は、塩基対内 (トランスナショナル: シフト、スライド、上昇、回転: 傾斜、ロール、ねじれ) および塩基対間 (トランスナショナル: せん断、スタガー、ストレッチ、回転: バックル、プロペラ、オープニング) の幾何学的パラメーターを、提案された値に関して範囲内か範囲外かで分析することです。^{[21] [22]}これらのパラメータは、2本の鎖（イントラ）内の2つの塩基対の相対的な向きと、2つの積み重ねられた塩基対（インター）の相対的な向きを記述し、したがって、これらを組み合わせることで、一般的な核酸構造を検証するのに役立ちます。RNAヘリックスの長さは短い（平均：10〜20 bps）ため、検証パラメータとして静電表面電位を使用することは、特にモデリングの目的で有益であることがわかりました ^{[23] 。}

球状タンパク質の場合、側鎖の内部原子パッキング（短距離の局所的相互作用から生じる）^{[24] [25] [26] [27] が}タンパク質フォールドの構造安定化に極めて重要であることが示されています。一方、フォールド全体の静電的調和（非局所的、長距離）^[28]もその安定化に不可欠であることが示されています。パッキング異常には立体衝突[29]、^[27] 、[27] 、 [ 28 ^{] 、 [30]}、^[31]などがありますが、静電的不調和^{[28] [32]}はタンパク質コアの部分電荷の不均衡を指します（設計されたタンパク質内部に特に関連します）。Molprobity の衝突スコアは非常に高い解像度で立体衝突を識別しますが、相補性プロットはパッキング異常と側鎖の静電的不均衡を組み合わせて、いずれかまたは両方のシグナルを示します。

炭水化物の分岐および環状の性質は、構造検証ツールに特別な問題をもたらします。^[35]高解像度では、共有結合修飾およびリガンドの両方として、オリゴ糖および多糖の配列/構造を決定することができます。しかし、より低い解像度（通常2.0Å未満）では、配列/構造は既知の構造と一致するか、質量分析などの補完的な技術によってサポートされる必要があります。^[36]また、単糖には明確な立体配座の好みがあります（飽和環は通常、椅子型立体配座で見つかります）^[37]が、モデルの構築および/または改良中に導入されたエラー（誤った結合キラリティーまたは距離、または誤ったモデルの選択 -炭水化物モデルの構築と改良に関する推奨事項については^[38]を、炭水化物構造の一般的なエラーに関するレビューについては^{[39] [40] [41]を}参照）により、原子モデルがより可能性の高い低エネルギー状態から外れる可能性があります。沈着した炭水化物構造の約20％は、構造データ（実空間相関係数を用いて測定）では正当化されない高エネルギー立体配座にある。^[42]

glycosciences.de では、多数の炭水化物検証 Web サービスが利用可能である (pdb-care による命名法チェックや結合チェックなど^[43]、GlycanBuilder を使用した質量分析データとの相互検証など)。一方、CCP4スイートでは現在、モデル構築および改良プロセス自体に統合されたツールである Privateer ^[33]を配布している。Privateer は、立体化学と位置化学、環の立体配座とパッカリング、結合ねじれ、正の省略密度に対する実空間相関をチェックし、環結合に非周期的なねじれ制約を生成することができ、これは単糖の最小エネルギー立体配座を維持するために任意の改良ソフトウェアで使用できる。^[33]

Privateerは、Essentials of Glycobiology ^[34]標準シンボル命名法に従って、すべての検証情報をツールチップ注釈として含むスケーラブルな2次元SVGダイアグラムも生成します（図を参照）。この機能は現在、分子グラフィックスプログラムCCP4mg（標準シンボル命名法^{[34]に準拠した}Glycoblocks 3D表現^[44]を介して）やスイートのグラフィカルインターフェイスCCP4i2など、他のCCP4プログラムに統合されています。

多くの評価基準は、実験構造全体にグローバルに適用されます。最も顕著なのは、解像度、データの異方性または不完全性、およびモデルとデータの全体的な一致を測定する残差または R 係数です (以下を参照)。これらは、ユーザーが関連するProtein Data Bankエントリの中から最も正確なものを選択して質問に答えるのに役立ちます。その他の基準は、局所電子密度マップへの適合や原子間の立体衝突など、3D 構造内の個々の残基または局所領域に適用されます。これらは、構造生物学者がモデルを改良する際に特に役立ちます。また、ユーザーが酵素活性や薬物結合部位など、関心のある場所のすぐ近くでモデルの信頼性を評価する際にも役立ちます。どちらのタイプの尺度も非常に便利ですが、グローバル基準は明示または公開しやすいものの、局所基準は科学的正確性と生物学的関連性に最も貢献します。Rupp の教科書に表現されているように、「幾何学と電子密度の両方の評価を含む局所検証のみが、構造モデルまたはモデルの局所的特徴に基づく仮説の信頼性を正確に把握できます。」^[45]

ＡＶＳ

割り当て検証スイート（AVS）は、BioMagResBank（BMRB）形式の化学シフトリストに問題がないかチェックします。^[46]

PSVS

情報検索統計に基づくNESGのタンパク質構造検証サーバー^[47]

プロセス

PROSESS (Protein Structure Evaluation Suite & Server) は、NMR 化学シフト、NOE、幾何学的パラメータ、知識ベースのパラメータによるタンパク質構造モデルの評価を提供する新しい Web サーバーです。

ラックス

化学シフトの線形解析は、化学シフト データの絶対参照に使用されます。

TALOS+。化学シフト データからタンパク質骨格のねじれ角を予測します。構造モデルの改良中に適用される追加の制約を生成するためによく使用されます。

NMR 構造アンサンブル検証の重要なニーズの 1 つは、よく決定された領域 (実験データがある領域) を、移動度が高い領域や観測データがない領域と区別することです。この区別を行うための現在または提案されている方法は、ランダム コイル インデックスなどいくつかありますが、これまでのところ、NMR コミュニティでは標準化されていません。

Cyro-EM では、観測される電子密度が個々の原子を分離するには不十分な場合が多く、エラーが発生する可能性が高くなるため、モデル作成者にとって特別な課題が生じます。

X線結晶構造解析で使用されるものと同様のジオメトリベースの検証ツールを使用すると、ありそうもないモデリングの選択肢を強調し、よりネイティブに近い構造にモデラーを導くことができます。Cα原子のみを使用するCaBLAM法^[48]は、 cyro-EMからの低解像度構造に適しています。^[49]

差分密度マップを計算する方法は、cyro-EM用に定式化されています。^{[50] [51]フリー}R因子の使用に匹敵する「フリー」マップを使用したクロスバリデーションも利用可能です。^{[52] [53]}モデルマップの適合を確認するための他の方法としては、相関係数、モデルマップFSC、^[54]信頼マップ、CryoEF（方向バイアスチェック）、およびTEMPy SMOCがあります。^[51]

SAXS（小角X線散乱）は、構造決定の分野で急速に成長している分野であり、初期段階や困難なケースのおおよその3D構造のソースとして、またNMR、EM、結晶学、架橋、または計算情報と組み合わせたハイブリッド法構造決定のコンポーネントとして使用されています。SAXSデータの解釈と結果のモデルの品質に対する信頼性の高い検証基準の開発には大きな関心が寄せられていますが、一般的に使用されている確立された方法はまだありません。この方向への最近の3つのステップは、世界的なタンパク質データバンクによる小角散乱検証タスクフォース委員会の設立とその最初のレポート^[55] 、出版物にデータを含めるための一連の推奨基準^[56]、および自動化された品質評価のための統計的に導き出された基準の最初の提案です。^[57]

個々の純粋に計算的な高分子モデルを、その分子の実験データなしで意味のある検証を行うことは困難である。なぜなら、最良の形状とコンフォメーションスコアを持つモデルが必ずしも正解に最も近いとは限らないからである。したがって、計算モデリングの検証では、方法の評価に重点が置かれている。バイアスや希望的観測を避けるために、二重盲検予測コンテストが組織されており、その最初の例（1994年以来2年ごとに開催）は、関連するコンテストが終了するまで秘密に保持される、新たに解明された結晶構造またはNMR構造の3Dタンパク質構造の予測を評価するCASP （構造予測の批判的評価）である。 ^[58] CASP評価の主な基準は、予測モデルと実験モデル間のCalpha位置の一致に対するGDT-TSと呼ばれる加重スコアである。^[59]

• 生物物理学的に重要な高分子結晶構造のリスト

• 計算予測
  • CASP実験ホームページ
  • Yasaraでのモデル検証
• 汎用構造検証
  • 検証/登録サイト (wwPDB バージョン)
  • MolProbity Web サービス (NMR 固有の機能があります)
  • PDBREPORT ([3]) タンパク質構造検証データベース
  • What_Check ソフトウェア 2011-05-01 にWayback Machineでアーカイブされました
  • ProCheck ソフトウェア
  • 相補性プロット
  • pdb-care (炭水化物の検証)
  • プライベーター（炭水化物検証）
  • OOPS2、ウプサラソフトウェアファクトリーの一部
  • ProSAウェブサービス
  • 検証-3Dプロファイル解析
  • NUPARM（核酸検証）
  • RNAhelix (RNA検証)
• X線
  • EDS (電子密度サーバー) 2017-07-02にWayback Machineでアーカイブ^[1]
  • Coot - モデリングソフトウェア（検証機能内蔵）[4] ^[2]
  • PDB-REDO - X線モデルの最適化：最新の技術を使用してすべてのPDBモデルを再構築および改良する^[3]
  • PROSESS - タンパク質構造評価スイートおよびサーバー
  • プロキシによる解決、ResProx - プロキシによるタンパク質モデルの解決
  • VADAR - 体積、面積、二面角レポーター
• 核磁気共鳴
  • PSVS（NESGのタンパク質構造検証サーバー）^[4]
  • CING (NMR構造生成のための共通インターフェース) ソフトウェア
  • ProCheck - X線およびNMRの立体化学品質チェック^[5]
  • TALOS+ ソフトウェア & サーバー (化学シフトからタンパク質骨格のねじれ角を予測するサーバー)
  • VADAR - 体積、面積、二面角レポーター
  • PROSESS - タンパク質構造評価スイートおよびサーバー
  • ResProx - プロキシによるタンパク質モデルの解決
• 凍結電子顕微鏡
  • EMデータバンク、EMマップの保管用
  • PDB の EMDB、地図の FTP ダウンロードに関する情報
  • CERESは、最新バージョンのPHENIX ^{[6]を使用してCyro-EMモデルを再構築（そしてできれば改善）します。}