呼吸測定

呼吸測定は「入ったものは必ず出てくる」という原理に基づいています。^{[ 6 ]}まず閉鎖系を考えてみましょう。マウスを気密容器に入れたと想像してください。容器内に密閉された空気は、最初は部屋に存在していたガスと同じ組成と割合のガスを含んでいます。20.95% O _2、0.04 % CO ₂、水蒸気（正確な量は気温によって異なります。露点を参照）、約 78% N _2、0.93 %アルゴン、そして残りはさまざまな微量ガスで構成されています（地球の大気を参照）。時間が経つにつれて、容器内のマウスはCO ₂と水蒸気を生成しますが、代謝要求に応じて空気からO ₂を取り込みます。したがって、システムの容積が分かっている限り、マウスをチャンバーに閉じ込めた開始時（ベースラインまたは基準条件）のO₂とCO₂の濃度と、マウスが後で空気を呼吸した後の濃度との_差は_、マウスによって生成/消費された_CO₂ /O₂_の量に等しくなります。窒素とアルゴンは不活性ガスであるため、その割合はマウスの呼吸によって変化しません。閉鎖系では、環境は最終的に低酸素状態になります。

開放系の場合、設計上の制約には、動物チャンバーの洗浄特性とガス分析装置の感度が含まれます。^{[ 7 ] [ 8 ]} しかし、基本原理は同じです。入ったものは出なければなりません。開放系と閉鎖系の主な違いは、開放系ではチャンバーに空気が流れる（つまり、ポンプで空気が押し出されたり引き込まれたりして、動物によって消費されたO _{2を常に補充し、動物によって生成された CO 2}と水蒸気を除去する速度であることです。体積流量は、動物がチャンバー内の酸素をすべて消費しないように十分に高くなければなりませんが、同時に、動物が検出に十分な O _{2 を} 消費するように十分に低くなければなりません。20 g のマウス の場合、 500 ml の容器を通して約 200 ml/分の流量で 良好なバランスが得られます。この流量では、約 40  ml の O ₂がチャンバーに供給され、チャンバー内の空気の全量が 5 分以内に交換されます。その他の小型動物の場合、チャンバーの容積ははるかに小さく、流量も調整されます。ただし、恒温動物（鳥類や哺乳類）の場合は、代謝率が高いため、チャンバーのサイズや流量はそれに合わせて選択されます。

開放型フローシステムの場合、機器や部品のリストは閉鎖型システムに比べて長くなりますが、開放型システムの最大の利点は、代謝率を連続的に記録できることです。また、開放型システムでは低酸素症のリスクもはるかに低くなります。

空気の流れをポンプで送る

• 真空ポンプ：ポンプは、動物チャンバーおよび呼吸測定フローシステムに空気を送り込む（上流側）か、空気を吸い込む（下流側）ために必要です。
• サブサンプルポンプ：分析装置を通して空気を吸引するために、小型で安定性と信頼性に優れたポンプが使用されます。

流量計および流量制御装置

• バブル流量計：流量を測定するシンプルかつ非常に正確な方法は、既知の体積の目盛りの間をガラス管を上昇する石鹸膜の泡の移動時間を計測することです。 ^{[ 11 ]}ガラス管は、底部（プッシュシステムの場合）または上部（プルシステムの場合）で空気流に接続されます。管の底部に取り付けられた小さなゴム製ピペットバルブは、石鹸の泡の貯蔵庫と供給システムの両方として機能します。操作は簡単です。まず、泡が移動する経路に沿ってガラス表面を濡らします（たとえば、バルブを押して大量の石鹸が空気の流れによってガラスを上昇するようにします）。これにより、ほぼ摩擦のない表面ができます。次に、バルブをつまんで、きれいな泡を1つ作ります。ストップウォッチを持って、泡がガラスの目盛りの間を移動するのに必要な時間を記録します。上側の目盛りに記録された体積（たとえば、125 = 125  ml）を記録し、その体積を目盛りの間を移動するのに必要な時間で割ると、流量（ml/s）が得られます。これらの器具は様々な供給元から購入できるが、適切なサイズのガラス製容量ピペットから自作することもできる。
• アクリル製流量計 ：流量が多い状況では、 代謝チャンバー内の流量を制御するために、シンプルなアクリル製流量計（0～2.5リットル/分）を使用する場合があります。流量計は代謝チャンバーの上流側に設置します。流量計は使い方は簡単ですが、呼吸測定システムで使用する場合は、1日に2回校正する必要があります。1回目は記録開始前（ただし、動物をチャンバー内に密閉した後）、2回目は記録終了時（動物をチャンバーから取り出す前）です。アクリル製流量計の校正マークは概算値に過ぎないため、校正は気泡式流量計で行う必要があります。流量を適切に校正するには、流量計を通過する空気の気圧と温度（室温とみなします）の両方を記録する必要があることを覚えておいてください。
• 質量流量計：酸素消費量または二酸化炭素生成量の計算に必要な式は、チャンバーへの流入量と流出量が正確に分かっていることを前提としています。当社では、温度や気圧に依存しない流量が得られるという利点を持つ質量流量計を使用しています。したがって、これらの流量は標準条件（標準温度圧力）に補正されているとみなすことができます。流量の測定と制御は、チャンバーの下流側の1箇所のみで行います。そのため、流入量と流出量が同一であると仮定する必要があります。ただし、呼吸測定システムの構築中は、流量の完全性を確認するために、すべてのステップ、すべての接続部で流量を測定する必要があります。
• ニードルバルブ：質量流量計は、流量を設定できる質量流量コントローラー付きで購入できます。ただし、これらは高価です。呼吸測定研究では、一度に複数の動物を測定することがよくあり、そのためには動物ごとに1つのチャンバーが必要となり、各チャンバーを通る流量を制御する必要があります。流量を制御するためのより費用対効果の高い代替方法は、ステンレス鋼または炭素鋼のニードルバルブを使用することです。ニードルバルブと質量流量計を組み合わせることで、目的の流量を費用対効果の高い方法で実現できます。バルブの価格は約20ドルです。

チューブとチャンバー

• チューブと接続部 ：呼吸測定システムの構成要素を動物チャンバーに接続するために、さまざまな種類のチューブを使用できます。システムの特性に応じて、さまざまな種類のフレキシブルチューブを使用できます。酸化性雰囲気が低い（例えば、オゾンがバックグラウンドレベルのみ）システムの領域では、アセチル、Bev-A-Line、Kynar、ナイロン、Tygonのチューブとコネクタを使用できます。オゾンに対して不活性なテフロンチューブは、かなりの量のオゾンが存在することが予想される場合に推奨されます。テフロンチューブは高価で、柔軟性に欠けます。
• 代謝チャンバー：チャンバーは、蓋にゴム栓が付いたガラス瓶、小動物や昆虫用の注射器の筒、またはプレキシガラス製のものがあります。理想的には、チャンバーは不活性材料で作られるべきです。たとえば、アクリル樹脂はO ₂を吸収する可能性があり、非常に小さな昆虫の呼吸測定には適さない場合があります。^{[ 12 ]}チャンバーは、チャンバー内でガスが迅速に混合されるように作られる必要があります。小型脊椎動物用の最も単純な代謝チャンバーは、栓付きのガラス瓶かもしれません。栓には2つのポートが取り付けられており、ライン接続用に短いテフロンチューブの延長部が設けられています。テフロンチューブの延長部を隔壁に通し、テフロンチューブの延長部の基部に小さなホースクリップを取り付けてライン接続を完了します。さらに、瓶内の入口ポートに延長部を設ける必要があります。これにより、動物の呼気ガスが流入流によって洗い流されないことが保証されます。動物は内部に密閉され、ゴム栓はベルクロストラップで固定されます。上流システムを使用する場合、代謝チャンバーからの漏れは動物の空気の損失につながり、その結果、動物の代謝率の過小評価につながります。代謝チャンバー内に動物を閉じ込める際には、シールに注意を払う必要があります。蓋を閉める前にしっかりと密閉されていることを確認するには、ストッパーを容器にしっかりと押し込み、均等になっていることを確認します。ストラップを1～2本（2本が望ましい）使用し、しっかりと引っ張ります。アクリル（プレキシガラス）製のチャンバーは用途によっては製造されますが、適切な装着を確保するには精密な設計が必要です。ガスケットが役立ち、ぴったりとフィットするクランプを適切に使用することで漏れを最小限に抑えることができます。
• スクラビングチューブ: 動物チャンバーの前後の水は除去する必要があります。 1 つの構成では、流入する気流を乾燥させるために上流 (プッシュポンプの前、動物チャンバーの前) にDrierite (8メッシュ (スケール)、つまり比較的粗い) の大きなアクリルカラムを使用し、動物チャンバーの後に水を除去するためにより細かいメッシュ (10〜20、つまり比較的細かい) Drierite のチューブをいくつか使用します。 スクラビングチューブを準備するには、分析装置に塵粒子が移動しないように、チューブの両端に少量の綿があることを確認してください。 綿は、チューブ内に塵が入らないようにするのに十分な量、例えば 0.005 g 程度で少量を使用します。 綿の量が多いと、湿ったときに空気の流れが妨げられます。 漏斗を使用して Drierite をチューブに注ぎ、チューブをベンチに軽く叩いて粒子をしっかりと詰めます (表面積を増やすため。空気と水は緩い Drierite を通過するため、スクラバーを頻繁に交換する必要があります)、少量の綿で蓋をします。動物チャンバーの前後で二酸化炭素を除去するために、Ascarite II を使用します (Ascarite II は Arthur H. Thomas Co. の登録商標です)。Ascarite II には腐食性の NaOH が含まれています (皮膚に付着させないようにし、水から遠ざけてください)。スクラビング チューブは、チューブの端に少量の綿を入れ、10～20 メッシュの Drierite を 3 分の 1 まで入れ、少量の綿を加え、さらにチューブの 3 分の 1 まで Ascarite II を入れ、綿をもう 1 層入れ、さらに Drierite を入れ、チューブを少量の綿で閉じて準備します。各層を追加するたびにチューブをベンチに軽く叩いて、粒子を詰めます。注: Drierite は (オーブンで加熱した後) 何度も使用できますが、表示 Drierite は繰り返し乾燥すると色が薄くなります。Ascarite II は 1 回使用し、有害廃棄物とみなされます。

分析装置

• 二酸化炭素分析計：CO₂_分析計は通常、赤外線検出方式を採用しています。これは、CO₂が赤外線を吸収し、わずかに長い波長の光を再放出するという性質を利用したものです_。分析計のパネルメーターには、0.01～10%のCO₂濃度範囲が表示され_{、データ記録のためにCO₂}濃度に比例した電圧出力も生成されます。
• 酸素分析装置：呼吸測定に適した酸素分析装置には、ガルバニック（「周囲温度」）、常磁性、ポーラログラフィー（クラーク型電極）、ジルコニウム（「高温」）センサーなど、さまざまな酸素センサーが使用されます。ガルバニック_O2分析装置は、酸性電解質、重金属アノード、薄いガス透過膜を含む燃料電池を使用します。アノード付近のO2_分圧はゼロであるため、 _{O2は周囲のO2}分圧に比例した速度で膜を介してアノードに拡散します。燃料電池は、膜における_O2分圧に比例した電圧を生成します。キャビネットの温度が安定しており、燃料電池を通過する空気の流れが安定していて範囲内であれば、応答は、サポートする電子機器、ソフトウェア、およびその他の考慮事項に応じて、0.01%以下になります。

最後に、コンピュータによるデータ収集および制御システムが、システムを完成させるための典型的な追加要素となります。チャートレコーダーの代わりに、コンピュータに接続されたアナログ-デジタル変換器を用いて、酸素消費量や二酸化炭素生成量の連続記録を行います。ソフトウェアは、実験者のニーズに合わせて信号をキャプチャ、フィルタリング、変換、表示します。呼吸測定分野には、さまざまな企業や個人がサービスを提供しています（例：Sable Systems、Qubit Systems、Warthog Systemsも参照）。

適切な培地に懸濁したサンプルを密閉された代謝チャンバーに入れる。基質または阻害剤を順次添加することで、ミトコンドリアを特定の「状態」にする。ミトコンドリアは酸素を消費するため、酸素濃度が低下する。この酸素濃度の変化は、チャンバー内の酸素センサーによって記録される。酸素濃度の低下率（酸素拡散補正を考慮）から、ミトコンドリアの呼吸速度を計算することができる。 ^{[ 13 ]}

通常の装置には、密閉可能な代謝チャンバー、酸素センサー、データ記録、撹拌、温度調節、およびチャンバーへの化学物質導入のための装置が含まれます。動物全体の呼吸測定について上述したように、材料の選択は非常に重要です。^{[ 13 ]}プラスチック材料は酸素貯蔵能力があるため、チャンバーには適していません。プラスチック材料が避けられない場合（たとえば、Oリング、撹拌機のコーティング、またはストッパーの場合）、酸素透過性が非常に低いポリマー（たとえばPTFEではなくPVDFなど）を使用できます。チャンバー材料へのまたはチャンバー材料からの残留酸素拡散は、測定された酸素フラックスを装置の酸素バックグラウンドフラックスで補正することによって対処できます。上述のコンポーネントで構成される装置全体は、しばしばオキシグラフと呼ばれます。上述の動物全体の呼吸測定装置を提供する企業は、通常、ミトコンドリア呼吸測定には関与していません。このコミュニティは、Oroboros Instruments、Hansatech、Respirometer Systems & Applications、YSI Life Sciences、Strathkelvin Instrumentsといった企業によって、価格帯や機能の面で非常に多様なサービスを受けている。