タンパク質膜ボルタンメトリー

電気化学において、タンパク質膜ボルタンメトリー（またはタンパク質膜電気化学、またはタンパク質の直接電気化学）は、電極上に固定化された（吸着または共有結合した）タンパク質の挙動を調べる技術です。この技術は、電子移動反応に関与するタンパク質と酵素に適用でき、酵素の速度論を研究するために利用できる方法の1つです。^[要出典]

タンパク質が電極表面と適切に接触し（電極とタンパク質間の電子移動が直接的）、変性していない限り、電極電位やその他の実験パラメータの関数として電流を監視することで、タンパク質を効果的に調査することができます。

様々な電極材料を使用することができる。^[1]膜結合タンパク質を扱うには特別な電極設計が必要である。^[2]

シトクロムやフェレドキシンなどの小さな酸化還元タンパク質は、その電気活性被覆率（直接電子伝達を受けるタンパク質の量）が十分に大きい（実際には、pmol/cm ²の数分の1より大きい）という条件で調査できます。

小さなタンパク質で得られた電気化学データは、タンパク質の酸化還元部位の酸化還元電位^[3] 、タンパク質と電極間の電子移動速度^[4] 、または電子移動と結合した化学反応（プロトン化など）の速度を測定するために使用できます。^[5]

吸着酸化還元タンパク質を用いたサイクリックボルタンメトリー実験では、各酸化還元部位の酸化と還元が正と負のピークのペアとして現れる。電位掃引中にサンプル全体が酸化または還元されるため、ピーク電流とピーク面積は走査速度に比例するはずである（ピーク電流が走査速度に比例していることは、ピークを与える酸化還元種が実際に固定化されていることを証明している）。^[3]同じことは、電極に吸着された非生物学的酸化還元分子を用いた実験にも当てはまる。この理論は、主に1980年代にフランスの電気化学者エティエンヌ・ラビロンによって開発された^{[4] 、[6] 、[7]}。

このファラデー電流（吸着分子の酸化/還元によって生じる）と容量電流（電極の充電によって生じる）は両方ともスキャン速度に比例して増加するため、スキャン速度を上げても同様にピークが見えるはずです。対照的に、酸化還元分析物が溶液中に存在し、電極に拡散したり電極から拡散したりする場合、ピーク電流はスキャン速度の平方根に比例します（ Randles-Sevcik の式を参照）。

スキャン速度に関係なく、ピークの下の面積（単位はAV）は に等しく、ここでは中心の酸化/還元で交換される電子の数、は電極表面、は電気活性被覆率（単位はmol/cm ² ）です。^{[3]したがって、後者は}容量電流を差し引いた後のピークの下の面積から推測できます。 ${\displaystyle nFA\Gamma \nu }$${\displaystyle n}$${\displaystyle A}$${\displaystyle \ガンマ}$

スキャン速度が遅い場合、酸化ピークと還元ピークの間に分離は発生しません。

• 1 電子サイト(例:ヘムまたは FeS クラスター) は、幅広いピークを生成します (図 1A)。ピークの形状と強度を与える式は次のとおりです。

${\displaystyle {\frac {i}{F^{2}\nu A\Gamma /RT}}=\pm {\frac {\exp \left({\frac {F}{RT}}(EE^{0})\right)}{(1+\exp \left({\frac {F}{RT}}(EE^{0})\right)^{2}}}}$

理想的には、ピーク位置は両方向にあります。ピーク電流は(スキャン速度 、および電極上の酸化還元サイトの量 に比例します) です。理想的な半値幅 (HWHH) は、20 °C で mV に相当します。非理想的な動作では、ピークが理想的な制限よりも広くなる場合があります。${\displaystyle E_{p}=E^{0}}$${\displaystyle i_{p}=F^{2}\nu A\Gamma /4RT}$${\displaystyle \nu}$${\displaystyle A\Gamma }$${\displaystyle RT/F\times \ln(3+2{\sqrt {2}})=89}$

• 2電子酸化還元部位（フラビンなど）のピーク形状は、半還元状態の安定性に依存します（図1B）。半還元状態が広範囲の電極電位にわたって安定している場合、信号は2つの1電子ピークの合計になります（図1Bの紫色の線）。半還元状態が不安定な場合、信号は単一のピーク（図1Bの赤線）になり、高さは1電子ピークの最大4倍、幅は半分になることがあります。^{[6] 、[8]}
• 複数の酸化還元中心を含むタンパク質は、すべて同じ面積（ でスケール）を持つ複数のピークを生成するはずです。${\displaystyle n}$

反応が単純な電子移動反応であれば、ピークは高速スキャン速度でも対称のままであるはずです。スキャン速度が のとき、ピーク分離が見られます。ここで は、バトラー・ボルマー理論における交換電子移動速度定数です。ラビロン方程式^{[4] 、[8] 、[9] は}、高速スキャン速度では、ピークが に比例して分離することを予測しています。が大きいか小さいほど、ピーク分離は大きくなります。ピーク電位は、^[4]で、図 2B の線で示されています (は電荷移動係数)。したがって、スキャン速度に対するピーク位置の実験的変化を調べると、界面電子移動速度がわかります。 ${\displaystyle \nu \gg RTk^{0}/F}$${\displaystyle k_{0}}$${\displaystyle \log(\nu /k^{0})}$${\displaystyle \nu}$${\displaystyle k^{0}}$${\displaystyle E_{p}=E^{0}\pm {\frac {RT}{\alpha F}}\ln {\frac {\alpha F\nu }{k^{0}RT}}}$${\displaystyle \alpha}$${\displaystyle k^{0}}$

結合反応とは、調査対象の種の酸化型と還元型の反応速度または平衡定数が同じではない反応です。たとえば、還元はプロトン化 ( ) に有利になります。プロトン化反応は での還元と結合しています。小さな分子 (プロトン以外) の結合も酸化還元反応と結合することがあります。 ${\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}} <pK_{a}^{\rm {red}}}$${\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}} <pH<pK_{a}^{\rm {red}}}$

結合反応が遅いか速いか（結合反応の時間スケールがボルタンメトリーの時間スケールより大きいか小さいかを意味する^[10] ）に応じて2つのケースを考慮する必要がある。 ${\displaystyle \tau =RT/F\nu }$

• 電子移動を伴う高速化学反応（プロトン化など）は、およびの見かけの値にのみ影響を及ぼしますが、^[7]ピークは対称性を維持します。配位子濃度への の依存性（たとえば、プールベ図にプロットされた pH へのの依存性）は、酸化還元種の酸化型または還元型から解離定数（たとえば、酸性度定数）を取得するために解釈できます。${\displaystyle E^{0}}$${\displaystyle k^{0}}$${\displaystyle E^{0}}$${\displaystyle E^{0}}$
• 非対称性は、電子移動と結合した（そして電子移動をゲートする）遅い化学反応によって生じる可能性がある。高速スキャンボルタンメトリーから、電子移動と結合した反応の速度に関する情報を得ることができる。可逆的な表面電気化学反応の後に不可逆的な化学反応が続くケースについては、Lavironが文献^{[6] 、[11]}で取り上げているが、データは通常、適切な微分方程式の数値解を使用して解釈される。^[9]${\displaystyle n=1}$${\displaystyle n=2}$

酵素の研究では、電流は酵素の基質の触媒酸化または還元によって生じます。

大きな酸化還元酵素（ラッカーゼ、ヒドロゲナーゼなど）の電気活性被覆率は、基質がない場合には信号を検出するには低すぎることが多いが、電気化学信号は触媒によって増幅される。実際、触媒電流は回転率と電気活性被覆率の積に比例する。電極電位、pH 、基質および阻害剤の濃度などを変化させた場合の効果を調べることで、触媒機構のさまざまな段階について知ることができる。^[8]

電極上に固定化された酵素の場合、特定の電位における電流の値は と等しくなります。ここで、は触媒反応で交換される電子の数、は電極表面、は電気活性被覆率、TOFはターンオーバー頻度（または「ターンオーバー数」）、つまり、1 秒あたりおよび吸着された酵素 1 分子あたりの基質分子の変換数です。後者は、がわかっている場合にのみ電流の絶対値から推測できますが、そのようなケースはめったにありません。ただし、実験条件を変更することで生じる電流の相対的な変化を分析することで情報が得られます。 ${\displaystyle \pm nFA\Gamma \times {\rm {TOF}}}$${\displaystyle n}$${\displaystyle A}$${\displaystyle \ガンマ}$${\displaystyle A\Gamma }$

TOF に影響を与える可能性のある要因は、(i) 酵素が固定されている電極への基質の質量輸送 (拡散と対流)、(ii) 電極と酵素間の電子移動速度(界面電子移動)、および (iii) 酵素の「固有の」活性であり、これらはすべて電極電位に依存する可能性があります。

酵素は、電極付近の基質の枯渇を防ぐために高速で回転する回転ディスク型作用電極（RDE）上に固定化されることが多い。その場合、酵素が吸着されている電極への基質の大量輸送は影響を及ぼさない可能性がある。

非常に酸化的または非常に還元的な条件下では、定常触媒電流は、（質量輸送の制限がない場合でも）それぞれ完全に酸化された酵素または完全に還元された酵素の活性に関連する限界値（プラトー）に向かうことがあります。界面電子移動が遅く、電子移動速度に分布がある場合（電極上の酵素分子の配向の分布に起因する）、電流はプラトーに達する代わりに電位とともに直線的に増加し続けます。その場合、限界勾配は完全に酸化された酵素または完全に還元された酵素のターンオーバー速度に比例します。^[8]

定常電流と電位の変化は複雑であることが多い（例えば、単なるシグモイド曲線ではない）。^[12]

もう一つの複雑さは、遅い酸化還元反応の存在から生じ、酵素の活性を変化させ、応答を定常状態から逸脱させる可能性がある。^[13]ここで遅いとは、 （不）活性化の時間スケールがボルタンメトリーの時間スケールに似ていることを意味する^[10] 。RDEを使用すると、これらの遅い（不）活性化は、質量輸送によるものではない触媒ボルタモグラムのヒステリシスによって検出される。ヒステリシスは、非常に速いスキャン速度（不活性化が進行する時間がない場合）または非常に遅いスキャン速度（（不）活性化反応が定常​​状態に達した場合）で消える可能性がある。^[14]${\displaystyle \tau =RT/F\nu }$

従来のボルタンメトリーでは、酵素-電極界面や反応に関与する種の構造について限られた情報しか得られません。標準的な電気化学を他の方法で補完することで、触媒作用のより完全な情報を得ることができます。^{[15] [16] [17]}