花粉管

雌胞子体は柱頭に付着した花粉を認識しなければなりません。多くの場合、同じ種の花粉のみが正常に成長できます。他家受粉花粉はより正常に成長します。^{[ 6 ] [ 7 ]}自家不和合性システムでは、他家受粉花粉が成長し、自家花粉との競争に打ち勝ちます。花柱と花粉の相互作用は適合性を検出し、花粉管の成長速度に影響を与えます。^{[ 8 ]}この選択プロセスは遺伝子レベルの制御に依存しており、雌しべの遺伝子座により、自家花粉はゆっくりと成長したり、成長を停止したり、破裂したりする一方で、他家受粉花粉はより速く成長します。自家不和合性システムは遺伝的多様性を維持します。^{[ 9 ] [ 10 ]}裸子植物に関しては、柱頭のある雌しべは含まれていません。したがって、花粉は受粉液滴に沈み、雄配偶体を露出した胚珠の卵に運びます。しかし、異なる種の花粉は液滴に沈みません。花粉は水面に浮いたままになり、液滴は珠孔の中に引き込まれる。^{[ 11 ]}

花粉粒が認識され水分を吸収されると、花粉粒は発芽して花粉管を伸ばします。^{[ 12 ]}この段階では、多くの花粉粒が卵細胞に到達しようと競い合うため、競争が生じます。柱頭は、多数の胚珠の場合、精子を受容可能な胚珠に導く役割を果たします。^{[ 12 ]}柱頭とのシグナルによって決定された適合する花粉粒のみが成長を許可されます。

花粉粒では、生殖細胞が精子を生成し、栄養細胞には花粉管を伸ばす管細胞があります。一部の植物は、柱頭と葯の成熟時期が異なる、または長さが異なるなど、自家受粉を防ぐための仕組みを備えており、これは次世代の遺伝的多様性の増加に大きく貢献しています。^{[ 13 ] [ 14 ]}

花粉管の成長速度には大きなばらつきがあり、多くの研究がシグナル伝達に焦点を当てています。^{[ 13 ]}花粉粒の遺伝子発現は、独自のmRNAと酵素を発現するため、親胞子体のものではなく配偶体のものであると特定されています。^{[ 13 ]}モモの木では、花粉管が成長する柱の環境が、胚珠への花粉管の成長に必要な栄養を提供します。^{[ 12 ]}花粉管は耐性があり、X線やガンマ線で損傷した花粉でも花粉管を成長させることができます。^{[ 13 ]}

花粉管の成長は、柱頭と花粉粒の相互作用によって影響を受ける。管の伸長は細胞骨格の伸長によって達成され、先端から伸びるが、これは細胞質内の高濃度のカルシウムによって制御されている。^{[ 10 ]} カルシウム濃度は、膜内のシナプス小胞の成長と先端での伸長を助ける。^{[ 7 ]}花柱に見られるポリペプチドも管の成長を制御し、成長のシグナル伝達に役割を果たす特定のペプチドが特定されている。

卵細胞に隣接する空間を占める助細胞から分泌されるLUREペプチドは誘引物質を利用できる。シロイヌナズナの変異体胚、特に助細胞を持たない胚では、花粉管は成長できなかった。^{[ 15 ]}花粉管の成長は、花粉と同じ種の卵細胞に向かう。種内シグナル伝達は、同じ種の卵細胞と精子の受精を助ける。花柱でのシグナル伝達は重要であり、花粉管は胚嚢がなくても花柱との相互作用だけで成長できる。^{[ 10 ] [ 6 ]}子房の他の部分には、miRNAなどの細胞質因子や、花粉管を助細胞に向かって成長させる化学勾配などがある。^{[ 6 ] [ 16 ]}

シロイヌナズナでは、カルシウムとエチレンが、 花粉管が子房の近くで成長する際に、花粉管の終結に関与している。カルシウムの増加により、2つの精細胞が花粉管から放出され、助細胞が退化する。^{[ 6 ]}カルシウムの化学勾配も、花粉管の成長の初期段階または適切な時期に終結に寄与する可能性がある。^{[ 16 ]}

花粉管の長さは種によって異なる。花粉管は振動しながら成長し、受精のために卵の近くに精子を放出する準備が整うまで続く。^{[ 17 ] [ 18 ]}ユリ、タバコ、およびインパチェンス・スルタニイでは、急速に成長する花粉管が観察されている。^{[ 18 ] [ 19 ]}成長速度は生物に有利に働くが、成長速度の変動が個体群に存在するのか、それとも適応度の向上により世代を超えて選択されてきたのかは明らかではない。^{[ 13 ]}

花粉管の進化と非運動性精子の進化との相関関係を示す多くの過渡的特徴が特定されている。^{[ 14 ]}シダなどの初期の種子植物は、胞子と運動性精子を持ち、水媒体中を泳ぎ、動物生殖と呼ばれる。^{[ 20 ]}被子植物の花粉管は単純で、分岐がなく、成長が速いが、これは祖先植物には当てはまらない。

イチョウやソテツなどの裸子植物では、吸器状の花粉管が形成されます。この管は雌の珠心から栄養分を吸収し、2段階で成長します。花粉管は高度に分岐しており、雌の胞子体組織上で成長します。まず、主管が成長し、その後、先端がより球形になり、造卵器の近くで精子が破裂できるようになります。^{[ 20 ]}二核で多鞭毛の精子は、その後、卵まで泳ぐことができます。^{[ 14 ]}ソテツは分岐構造が少なく、先端はイチョウと同じように膨らみます。しかし、ソテツでは、花粉管内で成長を制御するさまざまな酵素が特定されており、管の成長に伴って珠心組織がより損傷を受けます。^{[ 20 ]}

裸子植物の他の門であるマツ植物門とグネツム植物門では、精子は運動性がなく、花粉管が精子を卵に直接届ける過程は管受精と呼ばれる。マツは枝分かれしている場合と枝分かれしていない場合があり、雌組織が成長して組織が退化する。^{[ 20 ]}例えばマツは精子の細胞質を放出し、一方の精子が退化するにつれてもう一方の精子の融合が起こる。しかし、グネツム植物門では、花粉管が卵に到達する初期形態の二重受精において被子植物の花粉管により類似した特徴がある。しかし、胚乳は形成されず、2回目の受精は中断される。^{[ 14 ]}

被子植物では、花粉管が長い花柱を通って非常に速く成長し、十分に保護された卵細胞に到達するため、そのメカニズムはより広範囲に研究されています。被子植物の花粉管には大きな変異があり、ペチュニア、シロイヌナズナ、ユリ、タバコなどの多くのモデル植物が種内変異とシグナル伝達メカニズムについて研究されています。^{[ 13 ]}被子植物では、多くの胚珠が受精する多受精と呼ばれる現象が発生する可能性があり、花粉管の成長速度に関して生物の全体的な適応度はまだ研究されていません。^{[ 14 ] [ 13 ]}

アクチン細胞骨格は花粉管の成長を助ける上で極めて重要であることが証明されている。^{[ 23 ]}空間分布に関して言えば、アクチンフィラメントは花粉管内で3つの異なる構造に配置されている。^{[ 23 ]}それぞれの独自の配置、つまりパターンは、花粉管の特徴である極性細胞成長の維持に寄与している。先端領域（先端方向への成長の部位）では、アクチンフィラメントは少ないが、非常に動的である。さらに、先端には小さな小胞が蓄積しており、この領域が重要な小胞の標的化と融合イベントの部位であることを示している。このようなイベントは、花粉管の成長速度と方向を制御するために不可欠である。^{[ 24 ]}亜先端領域では、アクチンフィラメントは襟状の構造に配置されている。亜先端では逆噴水型の細胞質流動が起こり、細胞質流動の方向が反転して軸アクチンケーブルに沿ってシャンクが続く。シャンク領域は花粉管の中央部分を構成する。この領域では、アクチンフィラメントが均一な極性の軸方向の束に配列されており、それによって花粉管の基部から先端までさまざまな細胞小器官や小胞を輸送することが可能になり、管全体の成長を促進する。^{[ 24 ]}

アクチン細胞骨格の空間分布とダイナミクスは、アクチン結合タンパク質（ABP）によって制御されています。花粉管の成長中にアクチン細胞骨格で起こる分布の変化を実験的に観察するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）が使用されてきました。^{[ 23 ]} GFPは、植物のアクチンフィラメントを非侵襲的にイメージングする効率的な手段を提供するという事実から、主に動的な可視化の目的で選択されました。実験中に使用されたさまざまなGFPの中には、GFP-mTalin、LIM-GFP、およびGFP-fimbrin/ABD2-GFPがありました。^{[ 25 ]}しかし、これらのマーカーはそれぞれ、アクチンフィラメントの自然な構造を破壊するか、そのようなフィラメントを好ましくない方法で標識しました。例えば、GFP-mTalin は過剰なフィラメント束化を引き起こし、GFP-fimbrin/ABD2-GFP は花粉管の先端または亜先端領域にあるアクチンフィラメントを標識しませんでした。^{[ 25 ]}これらの欠点を考慮して、Lifeact-mEGFP が花粉管内のアクチンフィラメントの主要なマーカーとして指定されています。Lifeact-mEGFP はアクチンフィラメントの 3 つの配置すべてを検出することができ、アクチンフィラメントの自然な構造への影響は最小限です。^{[ 25 ]} Lifeact-mEGFP は、タバコ、ユリ、シロイヌナズナの成長中の花粉管内のアクチンフィラメントのダイナミクスを研究するためのマーカーとして使用されています。^{[ 25 ]}

GFPを用いた研究により、頂端領域に存在するアクチンフィラメントの動的な状態が花粉管の成長に不可欠であることが確認されている。GFP-mTalinで染色したアクチンフィラメントの実験では、先端に局在するアクチンフィラメントが非常に動的であることが確認されている。^{[ 26 ]}このような実験により、先端に局在するアクチンフィラメントの動態と、亜頂端領域におけるアクチン構造の形成におけるその役割との関連性が明らかになった。^{[ 26 ]}さらに、シロイヌナズナの頂端ドームに存在するアクチンフィラメントの実験では、花粉管の頂端膜からアクチンフィラメントが継続的に生成され、これらのアクチンフィラメントの生成はフォルミンによって媒介されることが示されている。これらの知見は、頂端領域に存在するアクチンフィラメントが非常に動的であり、小胞の標的化と融合イベントの場であるという理論を支持する証拠を提供している。暗所で生育させた胚軸細胞やBY-2培養細胞を用いた実験では、頂端膜から生成される非常に動的なアクチンフィラメントは、フィラメントの切断や脱分極によって反転するか、頂端から頂端側へ移動して花粉管の頂端領域におけるアクチンフィラメントの蓄積が減少することが示されている。^{[ 27 ]}

GFPを用いてシャンク領域のアクチンフィラメントの動態実験も実施した。その結果、この領域では最大フィラメント長が有意に増加し、切断頻度が有意に減少することが示された。このような結果は、シャンク領域に存在するアクチンフィラメントが、頂端領域および亜頂端領域に存在するアクチンフィラメントに比べて比較的安定していることを示している。^{[ 27 ]}

ABPはアクチン細胞骨格の組織化とダイナミクスを調節します。^{[ 27 ]}前述のように、アクチンフィラメントは頂端膜から継続的に合成されます。これは、膜に結合したアクチン核形成因子の存在を示しています。実験により、フォルミンがそのようなアクチン核形成因子の代表例であると理論化されています。たとえば、フォルミンAtFH5は、特に花粉管の頂端膜から合成されるアクチンフィラメントの核形成の主要な調節因子として同定されています。AtFH5の遺伝子ノックアウトにより、花粉管の頂端領域と亜頂端領域の両方でアクチンフィラメントの量が減少し、AtFH5が花粉管の頂端領域と亜頂端領域でアクチンフィラメント集合の核形成を行うという理論を裏付ける証拠が増えました。^{[ 27 ]}

クラスIフォルミンAtFH3は、別のアクチン核形成因子である。AtFH3は、花粉管の軸部に位置する縦方向のアクチンケーブルのアクチンフィラメント集合の核形成を行う。より具体的には、AtFH3はアクチン/プロフィリン複合体を利用してアクチンフィラメントの末端と相互作用し、それによってアクチンフィラメントの核形成を開始する。^{[ 27 ]}

花粉管が受精を達成するために細胞外の誘導シグナルにどのように反応するかを理解するため、広範な研究が行われてきました。^{[ 28 ] [ 21 ] [ 29 ] [ 30 ]}花粉管は雌しべを通過する際に、化学的、電気的、機械的な刺激の組み合わせに反応します。^{[ 31 ] [ 32 ] [ 33 ]}しかし、これらの外部刺激がどのように機能し、内部でどのように処理されるかは明らかではありません。さらに、外部刺激に対する感覚受容体はまだ特定されていません。それにもかかわらず、花粉管の成長過程において中心的な役割を果たすいくつかの側面がすでに特定されています。細胞骨格のアクチンフィラメント、特異な細胞壁、分泌小胞のダイナミクス、イオンの流れなどは、重要な基本的特徴として容易に特定できますが、その役割はまだ完全には解明されていません。

花粉管の成長中に発生するDNA損傷は、雄のゲノム情報が次の世代に無傷で伝達されるように修復される必要がある。植物Cyrtanthus mackeniiでは、二細胞性の成熟花粉は生殖細胞と栄養細胞から構成されている。^{[ 34 ]}精細胞は、花粉管伸長中の生殖細胞の有糸分裂によって生じる。栄養細胞は花粉管の発達を担っている。雌性配偶体への輸送過程において発生するDNAの二本鎖切断は、生殖細胞では効率的に修復されるが、栄養細胞では修復されないようである。^{[ 34 ]}

受精が起こるためには、雄性配偶子を胚珠に送り込む花粉管の先端が急速に成長する必要があります。花粉管は、成長領域である先端、移行領域である亜先端、および特定の細胞小器官を持つ通常の植物細胞のように機能する軸の 3 つの異なる領域から構成されています。^{[ 35 ] [ 36 ]}先端領域は、先端成長が起こる場所であり、分泌小胞の融合が必要です。これらの小胞の中には、主にペクチンとホモガラクツロナン (花粉管先端の細胞壁の一部) があります。^{[ 37 ]}先端領域のペクチンには、柔軟性を可能にするメチルエステルが含まれていますが、酵素ペクチンメチルエステラーゼがメチルエステル基を除去すると、カルシウムがペクチン間に結合して構造的サポートを与えることができます。^{[ 38 ]}ホモガラクツロナンは、細胞壁を緩めるために、エキソサイトーシスによって先端領域に蓄積されます。より厚く柔らかい、応力降伏強度の低い先端壁が形成され、これにより細胞の膨張が可能になり、先端の成長が促進される。先端の成長中には逆噴水状の細胞質流動が起こり、これは細胞膨張に不可欠である。なぜなら、この流動によって細胞小器官や小胞が軸部と先端下部の間で輸送されるからである。

アクチン細胞骨格は花粉管の成長において重要な因子である。なぜなら、極性細胞成長を維持するために、花粉管の異なる領域内には異なるパターンのアクチン細胞骨格が存在するからである。例えば、シャンク領域には、逆噴水状細胞質流動を制御するための縦方向のアクチンケーブルが存在する。^{[ 39 ]} F-アクチンは、亜頂端領域におけるホモガラクツロナンの完全小胞の蓄積を制御し、実質的に先端成長を媒介する。^{[ 40 ]}アクチンフィラメントは、花粉管が頂端領域で成長している間、頂端膜と細胞質の相互作用を制御する。^{[ 41 ]}頂端膜のF-アクチンは、花粉管の先端成長に不可欠なフォルミンと呼ばれるアクチン結合タンパク質を生成する。フォルミンは先端成長細胞で発現し、タイプIとタイプIIの2つのサブグループに分けられる。タイプIフォルミンはアクチン構造を生成し、細胞分裂に関与する。一方、II型フォルミンは、先端成長に必要な極性細胞の成長に寄与する。^{[ 42 ]}先端成長は極度の極性成長の一形態であり、この極性プロセスにはアクチン結合タンパク質を介したアクチン細胞骨格の組織化が必要である。この先端成長に必要な必須タンパク質は、アクチン組織化タンパク質であり、イネ形態決定因子（RMD）と呼ばれるII型フォルミンタンパク質である。RMDは花粉管の先端に局在し、F-アクチンアレイの極性と組織化を調節することによって花粉管の成長を制御する。^{[ 43 ] [ 44 ]}

RMDは花粉の発芽と花粉管の成長を促進することが、数多くの実験によって証明されています。最初の実験では、rmd-1変異体（機能的なRMDを持たないイネ）と野生型イネ（機能的なRMDを持つ）の雌しべと柱頭の特徴を比較しました。rmd-1変異体では、雄しべと雌しべが野生型よりも短くなりました。この実験から、RMDが花粉の発達に不可欠であることが示されました。野生型イネは発芽率が高く、rmd-1変異体は発芽率が低いことが、液体発芽培地で両方を発芽させたときに確認されました。発芽率をテストした後、2つの植物の花粉管の長さと幅を比較しました。野生型植物の花粉管は変異体よりも長く、変異体の花粉管は幅が広くなりました。変異体の花粉管の幅が広いことは、極性細胞の成長の減少、ひいては先端成長の減少を示しています。次に、野生型と変異体の花粉粒を採取し、野生型と変異体の受粉活動を比較した。変異体では活動が低下し、侵入も最小限であったのに対し、野生型では活動が増加し、花柱を通って雌しべの底まで侵入していた。これらの観察結果は、rmd-1変異体では花粉管の成長が遅れていることを示している。さらに、野生型と変異体の間で受精率に影響はなく、これは野生型と変異体の種子形成率を測定することによって検証された。両者とも種子形成率は同程度であることがわかった。したがって、RMDは受精には影響せず、先端成長にのみ影響する。^{[ 44 ]}

野生型植物の全花、外穎、内穎、鱗被、雌しべ、葯、成熟花粉粒から全RNAを抽出し、植物全体でRMDが特異的に発現している場所を調べた。RT-qPCR（逆転写定量PCR）を用いて、植物の各部位でRMD転写産物の量が異なることが明らかになった。次に、RT-PCR（逆転写PCR）とユビキチンをコントロールとして用いて、植物の各部位でRMDがどこに存在するかを明らかにした。これらの2つの方法により、外穎、雌しべ、葯、成熟花粉粒にRMD転写産物が豊富に存在することが示された。これらの結果を確認するために、別の方法を行った。この方法では、RMDプロモーター領域とGUSをコードするレポーター遺伝子を融合させた形質転換植物を用いた。^{[ 44 ]}これらの形質転換植物の組織を組織化学的に染色したところ、雌しべ、葯壁、成熟した花粉粒内に高いGUS活性が認められた。したがって、これらの結果を総合すると、RMDは植物のこれらの特定の器官で発現していることが示された。

RMDが花粉管内のどの部位で特異的に発現しているかを調べるため、GUSシグナルの検出を再度行った。まず、proRMD::GUS形質転換植物から花粉粒を採取し、成熟した花粉粒内に強いGUSシグナルが存在することを確認した。次に、これらの花粉粒を試験管内で発芽させ、花粉管の先端部でGUSシグナルを観察した。しかし、これらのGUSシグナルの強度は発芽段階によって異なった。発芽初期段階では花粉管先端部のGUSシグナルは弱かったが、発芽後期段階では強くなった。したがって、これらの結果は、RMDが花粉の発芽と花粉管の成長に関与していることを示唆している。

RMDはII型フォルミンであり、ホスファターゼ（PTEN）様ドメイン（タンパク質の局在化に関与）とFH1およびFH2ドメイン（アクチン重合を促進）から構成される。^{[ 45 ] [ 46 ] [ 44 ]} RMDの局在を花粉管内で発見するために、タバコの成長中の花粉管の一過性アッセイを実施し、蛍光タンパク質GFPを使用した。特定の条件下でのさまざまな花粉管の多くの共焦点画像が観察された：pLat52::eGFP（花粉特異的Lat52プロモーターによって駆動される単一のeGFPであり、これはコントロールとして機能する）；pLat52::RMD-eGFP（RMDタンパク質とeGFPの融合）；pLat52::PTEN-eGFP（PTENドメインとeGFPの融合）；そしてpLat52::FH1FH2-eGFP（FH1ドメインとFH2ドメインをeGFPと融合させたもの）を用いた。コントロールの画像とpLat52::RMD-eGFPの画像を比較すると、単一のGFPはチューブ全体に広がっていたのに対し、RMD-eGFPはチューブの先端部に蓄積していることが観察された。したがって、これはRMDが花粉管の先端部に局在していることを示している。

PTEN様ドメインがRMDの局在に関与しているかどうかを調べるため、PTENドメインを融合させたGFPと、PTENドメインを欠損させた短縮型RMD（pLat52::FH1FH2-eGFP）の共焦点顕微鏡画像を比較した。PTEN-eGFPシグナルはRMD-eGFPシグナルと同様に花粉管の先端に局在していたが、FH1FH2-eGFPシグナルは花粉管全体に分布しており、極性のある局在は見られなかった。これらの結果を総合すると、PTEN様ドメインが花粉管におけるRMDの先端局在に関与していることが示された。

RMDが花粉管内のFアクチン構造を制御しているかどうかを判断するため、野生型およびrmd-1変異体の成熟花粉粒におけるFアクチン配列をAlexa Fluor 488-ファロイジン染色を用いて観察した。野生型花粉粒の開口部周辺には強く束ねられたアクチンフィラメントが存在していたが、rmd-1変異体花粉粒の開口部周辺にはアクチンフィラメントの蓄積は見られなかった。さらに、rmd-1変異体花粉粒内ではアクチンフィラメントのシグナルは弱く、構造もランダムであった。これらの結果は、RMDが花粉の発芽制御に不可欠であることを裏付けている。

花粉管内のアクチンフィラメント密度を観察するために、統計解析を用いて蛍光強度を測定した。^{[ 47 ]} rmd変異体花粉管の軸部領域では蛍光強度が高かったため、この領域にはF-アクチンの密度が高いことがわかった。しかし、rmd変異体花粉管の先端部領域では、野生型花粉管と比較してF-アクチンの密度が低いことが観察された。これは、機能的なRMDがない場合、花粉管のF-アクチン分布パターンが変化することを示している。

アクチンケーブルの極性を決定するために、アクチンケーブルと花粉管の伸長軸との間の角度を測定した。野生型花粉管の軸部領域の角度は主に20°未満であったのに対し、rmd変異体花粉管の角度は60°以上であった。これらの結果は、rmd変異体花粉管（機能的なRMDを持たない）は幅が増加し、その結果先端成長が減少したことから、RMDが極性のある先端成長に不可欠であることを裏付けている。花粉管内の極性を調べるために、伸長中の花粉管の先端から軸部領域までのFアクチンフィラメントの単一ケーブルの最大長も測定した。rmd変異体花粉管のFアクチンケーブルの最大長は、野生型花粉管のものと比較して短かった。したがって、これらの結果を総合すると、アクチン線維の適切な組織化と管の先端における正常なFアクチン密度は、RMDが存在する場合にのみ達成されることが裏付けられる。