酵素のメカニズム この反応は以下の段階を経て進行すると考えられている。
Fe(II)-OO-BH 4 ブリッジの形成。 OO結合のヘテロリティック開裂によりフェリルオキソ水酸化中間体Fe(IV)=Oが生成する Fe(IV)=Oへの攻撃によりフェニルアラニン基質がチロシンに水酸化される。[ 7 ] PAHのメカニズム、パートI 鉄-ペルオキシプテリン架橋の形成と切断。 証拠は、Fe(IV)=O が水酸化中間体であることを強く支持しているが、[ 8 ] 依然として 議論の的となっている。鉄とプテリン補因子の近接性および触媒作用中に鉄に配位すると想定される水分子の数が異なるモデルに基づいて、2 つの経路が提案されている。1 つのモデルによれば、鉄二酸素錯体が最初に形成され、Fe2+O2 と Fe3+O2− の共鳴混成体として安定化される。 活性 化 された O2が BH4を 攻撃 し、電子不足のプテリン環と電子豊富な二酸素種との間の電荷分離を特徴とする遷移状態を形成する。 [ 9 ] 架橋 が形成される。一方、この架橋の形成は、BH4 が鉄の第一配位殻に位置し、鉄がどの水分子にも配位していないと仮定してモデル化されている。このモデルは、プテリンラジカルとスーパーオキシドが重要な中間体となる別のメカニズムを予測している。[ 10 ] 架橋 は、OO 結合のヘテロリティック開裂によって Fe(IV)=O と 4a-ヒドロキシテトラヒドロビオプテリンに切断される。したがって、分子状酸素は、プテリン環とフェニルアラニンを水酸化するために使用される両方の酸素原子の供給源となる。
PAHのメカニズム、パートII フェリルオキソ中間体によるフェニルアラニンの水酸化。 このメカニズムには、ペルオキシプテリンではなく Fe(IV)=O 水酸化中間体が関与するため、BH 4 補因子の酸化とフェニルアラニンの水酸化は分離され、BH 4の非生産的な消費と H 2 O 2 の生成につながる。[ 7 ] [ 7 ] [ 7 ] [ 11 ] [ 12 ] プテリン補因子は、PAHのカルビノールアミン生成物の水和によってキノノイドジヒドロビオプテリン（qBH 2 ）に再生され、その後、BH 4 に還元される。[ 13 ]
構造 PAHモノマー（51.9 kDa）は、3つの異なるドメインから構成されています。Phe結合ACTサブドメインを含む調節N末端ドメイン（残基1～117）、触媒ドメイン（残基118～427）、および同一モノマーのオリゴマー化に関与するC末端ドメイン（残基428～453）です。特にプテリンと鉄が配位した触媒ドメインについて、活性部位を調べるために広範な結晶学的解析が行われました。N末端調節ドメインの構造も決定され、相同チロシンヒドロキシラーゼC末端四量体化ドメインの解明された構造とともに、四量体PAHの構造モデルが提案されました。[ 13 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]
PAHの活性部位がBH4、鉄(II)、およびフェニルアラニン類似体に結合したモデル。（PDB 1KW0より）フェニルアラニン類似体 、BH4 、鉄 、Fe(II)配位HisおよびGlu残基
触媒ドメイン 触媒ドメインの結晶構造解析によると、活性部位は主に疎水性残基で裏打ちされた開放的で広々としたポケットで構成されているが、3つのグルタミン酸残基、2つのヒスチジン、およびチロシンも存在し、鉄と結合している。[ 13 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]
N末端調節ドメイン N末端ドメイン（残基1～117）の調節的性質は、その構造的柔軟性によってもたらされる。[ 23 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] さ れない 。[ 26 ] [ 25 ] [ 25 ]
四量体化ドメイン 原核生物のPAHは単量体であるのに対し、真核生物のPAHはホモ四量体とホモ二量体の平衡状態にある。[ 7 ] [ 13 ] [ 13 ] [ 7 ] [ 13 ] [ 27 ] [ 27 ]
疾患との関連性 PAH の変異による PAH 活性の欠損は高フェニルアラニン血症 (HPA)を引き起こし、血中フェニルアラニン濃度が正常濃度の 20 倍を超えると、代謝性疾患であるフェニルケトン尿症 (PKU) が発症する。[ 28 ] [ 13 ] [ 20 ] [ 13 ] 4 は薬理学的治療として投与されており、遺伝子型が残存 PAH 活性をもたらすものの BH4 4 合成や再生に欠陥のない PKU 患者の一部において、血中フェニルアラニン濃度を低下させることが示されている。追跡調査では、特定の PAH 変異体の場合、過剰な BH4 4が 薬理学的シャペロン として働き、四量体形成が破壊され、タンパク質分解切断や凝集に対する感受性が高まった変異酵素を安定化させることが示唆されている。[ 30 ]
フェニルケトン尿症は不可逆的な損傷を引き起こす可能性があるため、フェニルアラニン水酸化酵素の欠損を早期に発見することが不可欠です。当初は、ガストリー試験として知られる細菌阻害アッセイを用いて診断が行われていました。現在では、多くの国で 新生児スクリーニング の一環としてPKUが検査されており、出生直後にタンデム質量分析 法を用いてフェニルアラニン値の上昇が測定されます。フェニルアラニンを少なく、チロシンを多く含む食事療法を行うことで、長期的な発達障害を防ぐことができます。
PAHノックアウトモデル Pah -KOマウスモデルを作成する最初の試みは、2021年に発表された研究論文で報告された。[ 31 ] ノックアウトマウスは、 CRISPR / Cas9 を使用してC57BL/6J系統内で開発され、ホモ接合体となった。[ 32 ] Pah 遺伝子のコドン7、GAGは、終止コドンTAGに変更され、意図的な点突然変異 を示した。生後2～6ヶ月の雄のホモ接合体マウスは、行動および生化学的アッセイ、MRI、組織病理学などの科学的方法によって研究された。ホモ接合体マウスは、野生型 マウスと同様のフェニルアラニンおよびチロシンレベルを供給するのに十分なPAH酵素活性を発現する、年齢および性別が一致するヘテロ接合体Pah -KOマウスである対照マウスと定期的に比較された。
Pah -KOマウスモデルは、ヘテロ 接合 体マウスと比較して、血中フェニルアラニン濃度が高くチロシン濃度が低く、低コレステロール血症、脳内フェニルアラニン濃度が高く神経伝達物質とチロシン濃度が低く、髄鞘形成不全、脳と体重の低下、眼病理のグレードが高い、色素沈着低下 、および進行性の行動障害を示した。[ 31 ] ウェスタンブロット 分析により肝臓のPAHタンパク質は検出されなかった。[ 33 ] [ 31 ]
このモデルは、PKU患者に類似したPKU生物学の広範な研究や、PKU治療のための最新の治療戦略の評価の可能性を切り開くものである。
フェニルアラニン水酸化酵素は、他の2つの酵素と密接に関連している。
これら3つの酵素は相同性があり、つまり、同じ古代のヒドロキシラーゼから進化したと考えられている。
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