混合研究

混合試験は、ループス抗凝固因子などの因子阻害因子、または第 VIII 因子に対する抗体などの特定の因子阻害因子による因子欠乏を区別するために、患者または被験者の血漿に対して行われる検査です。^[1]混合試験は、凝固検査室で広く行われているスクリーニング検査です。これらの検査の基本的な目的は、プロトロンビン時間(PT)、部分トロンボプラスチン時間、または場合によってはトロンビン時間(TT) の延長の原因を特定することです。混合試験は、因子レベルが正常値の 50 % であれば、プロトロンビン時間(PT) または部分トロンボプラスチン時間(PTT) の結果が正常になるという事実を利用しています。 ^[2]

試験方法

新鮮な正常血漿には、すべての血液凝固因子が正常レベルに含まれています。

問題が単純な因子欠乏である場合、患者の血漿を正常因子レベルの 100% を含む血漿と 1:1 で混合すると、混合物のレベルは 50% 以上になります (患者の活性が 0% の場合、100% + 0% の平均 = 50%)。^[3] PT または PTT は正常になります (混合試験では修正が示されます)。混合による修正は因子欠乏を示します。混合による修正が失敗した場合は、インヒビターが存在します。試験血漿でトロンビン時間を測定すると、抗凝固剤、低フィブリノーゲン血症、または異常フィブリノーゲン血症の存在を示すなど、混合試験の解釈に役立つ追加情報が得られます。^[4]

吸着血漿と熟成血漿

因子欠乏血漿（吸着血漿や熟成血漿など）は、歴史的に混合研究に使用されてきました。因子欠乏が判明している血漿は市販されていますが非常に高価なため、研究室で調製され、混合試験に使用されてきました。吸着血漿または経口抗凝固薬（ワルファリンなど）を1週間以上服用している患者の血漿は、因子II、因子VII、因子IX、因子Xが欠乏しています。経口抗凝固薬（ワルファリンなど）を48～72時間服用している患者の血漿は、因子VIIが欠乏しています。熟成血漿は、因子Vと因子VIIICが欠乏しています。血清は、因子I、V、およびVIIICが欠乏しています。

プロトロンビン時間の補正

プロトロンビン時間（PT）は以下のように補正される：^[5]^[6]

部分トロンボプラスチン時間の補正

部分トロンボプラスチン時間（PTT）は以下のように補正される：^[5]

時間依存性阻害剤

一部の阻害剤は時間依存性があります。つまり、抗体が添加された凝固因子と反応して不活性化するには時間がかかります。検体を混合した直後に実施された凝固試験では、抗体が標的因子を不活性化する時間がなかったため、補正が示される場合があります。混合物を 37°C で 1 ～ 2 時間インキュベートした後に実施された試験では、即時混合後に得られた凝固時間よりも大幅に延長した結果が得られます。ループス抗凝固剤などの非特異的阻害剤は通常、時間依存性がなく、即時混合すると延長が見られます。多くの特異的因子阻害剤は時間依存性があり、インキュベーション後に試験を繰り返さない限り阻害剤は検出されません (因子 VIII 阻害剤はこの点で有名です)。^[7]

凝固検査結果異常

よくある問題は、PT および/または PTT の原因不明の上昇である。これが認められる場合は、新鮮な検体で検査を繰り返す必要がある。もう 1 つの考慮事項はヘパリンである。血液サンプルが誤ってランニングラインから採取された可能性がある。ヘパリンによる干渉は、ヘパリンを樹脂で吸収する (「Heparsorb」) か、ヘパリンを分解する酵素を使用する (「Hepzyme ^{[8] 」) ことによって検出できる。また、特に抗凝固薬の使用や}肝疾患に関して、患者の病歴を確認する必要がある。異常な結果が新鮮な検体で再現され、病歴から明らかな説明がない場合は、混合検査を行う必要がある。混合検査で修正が示され、培養による延長が見られない場合は、第 VIII 因子および第 IX 因子から始めて、因子欠乏を探す必要がある。ビタミン K欠乏症、または偶発的または隠れたワルファリン摂取を除外するために、ビタミン K 依存性および非ビタミン K 依存性因子を考慮する必要がある。

阻害剤

混合試験で改善しない場合は、インヒビターが疑われる。^[9]^[10]最も一般的なインヒビターは、ループス抗凝固薬などの非特異的インヒビターである。^[9]血小板中和法などのリン脂質依存性抗体を証明する検査を実施する。凝固因子に対する特異的インヒビターが自発的に発生し（つまり、血友病患者には発生しない）、最も多いのは第 VIII 因子に対するインヒビターである。^{[11]これは、}全身性エリテマトーデス、モノクローナル免疫グロブリン血症、その他の悪性腫瘍の患者、妊娠中、および明らかな理由なく（特発性）発生する可能性がある。これらの患者は壊滅的な出血を起こす可能性がある。すべきことは、関与している特定の因子を特定し、その力価がどのくらい高いかを調べることである。患者の力価の低いインヒビターの場合は、高用量の因子でそれを圧倒するようにしてください。患者が第VIII因子に対する高力価抗体を持っている場合、出血を止めるために豚第VIII因子、活性化プロトロンビン複合体濃縮物FEIBA（第8因子阻害因子バイパス剤）^[12] 、またはノボセブン^{[13]を試してください。}プレドニゾンは時間の経過とともに力価を下げることがよくあります。静脈内免疫グロブリンも効果があると報告されていますが、阻害因子を持つ血友病患者には効かないようです。リツキシマブ、シクロホスファミド、またはその他の免疫抑制療法が必要になる場合があります。^[14]

混合研究の修正の評価

インヒビター欠損と因子欠乏を区別するための特定のカットオフ値を提供するために、「ロスナー指数」（循環抗凝固因子指数）^[15]および/または「チャンパーセンテージ」（パーセント補正法）を使用することができる：^[16]

$Rosner\;index={\frac {(aPTT\;of\;1:1\;mix)-(aPTT\;of\;normal\;pooled\;plasma)}{aPTT\;of\;nonmixed\;patient\;plasma}}x100$

結果は、≤10は修正として分類され、≥15は阻害因子の存在を示し、11-15は「不確定」として分類されます。^[17]

$Chang\;percentage={\frac {(aPTT\;of\;nonmixed\;patient\;plasma)-(aPTT\;of\;1:1\;mix)}{(aPTT\;of\;nonmixed\;patient\;plasma)-(aPTT\;of\;normal\;pooled\;plasma)}}x100$

結果は以下のように分類されます：<58%が阻害因子、>70%が補正因子です。^[18] >

あるいは、基準範囲内への補正を使用して完全な補正を定義することもできます。^[19]

4 番目の方法は、推定因子補正 (EFC) として知られています。この方法は 4 つのステップで構成されます。まず、PT、aPTT、および臨床歴に基づいて、欠乏している可能性が最も高い因子を特定します。次に、適切な曲線 (単一因子欠乏、ビタミン K 依存性因子欠乏、または全因子欠乏) を選択します。この曲線を使用して、患者サンプルの因子レベルを推定します。次に、欠乏の場合に 1:1 混合後に発生する因子レベルと PT または aPTT を予測します。最後に、実際の混合結果と欠乏の予測結果を比較します。^[19]

参考文献

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