4Pi顕微鏡

4Pi顕微鏡は、軸方向の分解能が向上したレーザー走査型蛍光顕微鏡です。これにより、500～700 nmの典型的な軸方向分解能の範囲が100～150 nmに向上し、標準的な共焦点顕微鏡の5～7倍の体積でほぼ球形の焦点スポットに相当します。^[1]

解像度の向上は、2 つの対向する対物レンズを使用することで実現します。この 2 つのレンズは、どちらも同じ幾何学的位置に焦点を合わせます。また、2 つの対物レンズのそれぞれの光路長の差は、最小限になるように慎重に調整されます。この方法により、両方の対物レンズの共通焦点領域にある分子は、両側からコヒーレントに照射され、反射光または放射光もコヒーレントに収集されます。つまり、検出器上で放射光をコヒーレントに重ね合わせることができます。照射と検出に使用される立体角は増加し、最大に近づきます。この場合、サンプルはすべての側面から同時に照射され、検出されます。 ${\displaystyle \オメガ}$

4Pi 顕微鏡の動作モードを図に示します。レーザー光はビーム スプリッターによって分割され、ミラーによって 2 つの反対側の対物レンズに向けられます。共通の焦点では​​、両方の焦点を合わせた光線の重ね合わせが行われます。この位置で励起された分子は蛍光を発し、この蛍光は両方の対物レンズによって収集され、同じビーム スプリッターによって結合され、ダイクロイック ミラーによって検出器に偏向されます。そこで、両方の放射光経路の重ね合わせが再び発生します。

理想的な場合、各対物レンズは の立体角から光を集めることができます。 2 つの対物レンズを使用すると、あらゆる方向から光を集めることができます (立体角)。 このタイプの顕微鏡の名前は、励起と検出に可能な最大立体角に由来しています。 実際には、対物レンズで達成できる開口角は約 140° であり、これは に相当します。 ${\displaystyle \Omega =2\pi }$${\displaystyle \Omega =4\pi }$${\displaystyle \オメガ \approx 1.3\pi }$

顕微鏡は 3 つの異なる方法で操作できます。タイプ A の 4Pi 顕微鏡では、励起光のコヒーレントな重ね合わせを使用して解像度が向上します。放出光は、片側からのみ検出されるか、両側から非コヒーレントな重ね合わせで検出されます。タイプ B の 4Pi 顕微鏡では、放出光のみが干渉します。タイプ C モードで操作すると、励起光と放出光の両方が干渉し、最高の解像度の向上が実現します (共焦点顕微鏡と比較して、光軸に沿って約 7 倍)。

実際の 4Pi 顕微鏡では、すべての方向から均等に光を照射または収集することができないため、点像分布関数にいわゆるサイドローブが発生します。通常 (常にではありませんが)、 4Pi 顕微鏡では、 2 光子励起顕微鏡を放出ピンホールと組み合わせて使用​​し、これらのサイドローブを許容レベルまで下げます。

1971年、クリストフ・クレマーとトーマス・クレマーは、完全なホログラム、すなわち点光源の放射の全フィールド情報を全方向に伝えるホログラムの作成を提案しました。^{[2] [3]}しかし、1978年の出版物^[4]は 、不適切な物理的結論（すなわち、点状の光点）を導き出し、立体角の反対側を追加することによる実際の利点である軸方向の解像度の向上を完全に見逃していました。^[5] 4Pi顕微鏡の実用的なシステム、すなわち2つの反対の干渉レンズを備えたセットアップの最初の説明は、1991年にステファン・ヘルによって発明されました。 ^[6]彼は1994年にそれを実験的に実証しました。^[7]${\displaystyle 4\pi }$

その後、この顕微鏡の用途は増えていきました。例えば、サンプル内の64個のスポットを同時に励起・検出し、空間分解能を向上させたことにより、2002年には4Pi顕微鏡で酵母細胞内のミトコンドリアの動態を記録することに成功しました。 ^{[8]顕微鏡メーカーの}ライカマイクロシステムズ社は2004年に商用バージョンを発売しましたが^[9]、その後製造中止となりました。

これまで、4Pi顕微鏡の最高品質は、誘導放出抑制（STED）原理などの超解像技術と組み合わせて達成されてきました。^[10]適切な励起ビームと脱励起ビームを備えた4Pi顕微鏡を使用すると、均一な50nmサイズのスポットを作成することができました。これは、固定細胞における共焦点顕微鏡と比較して焦点体積が150〜200倍減少したことに相当します。4Pi顕微鏡とスイッチングタンパク質を備えたRESOLFT顕微鏡を組み合わせることで、低光レベルで40nm未満の等方性解像度で生細胞の画像を撮影できるようになりました。^[11]

• 誘導放出抑制顕微鏡（STED）
• 多焦点平面顕微鏡（MUM）