DNAアデニンメチルトランスフェラーゼの同定

DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ同定法（略称はDamID）^[1]は、真核生物におけるDNAおよびクロマチン結合タンパク質の結合部位をマッピングするために使用される分子生物学プロトコルである。DamIDは、提案されたDNA結合タンパク質をDNAメチルトランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させることにより、結合部位を特定する。目的のタンパク質がDNAに結合すると、メチルトランスフェラーゼが結合部位の領域に局在する。アデニンメチル化は真核生物では自然には起こらないため、どの領域におけるアデニンメチル化も融合タンパク質によって引き起こされたと結論付けることができ、その領域が結合部位の近くにあることを意味する。DamIDは、ChIP-on-chipまたはChIP-seqの代替法である。^[2]

説明

原理

N6-メチルアデニン（m6A）は、アデニンの6番目の位置にメチル基（CH ₃ ）が付加された生成物である。この修飾ヌクレオチドは、C. elegans ^{[3]を除く大多数の真核生物には存在しないが、}制限修飾またはDNA修復システムの一部として細菌ゲノム中に広く存在している^{[4] 。}大腸菌では、アデニンメチル化はアデニンメチルトランスフェラーゼDam（DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ）によって触媒され、この酵素は回文配列GATC内でのみアデニンメチル化を触媒する。真核細胞内でのDamの異所性発現は、他の顕著な副作用なしにGATC配列内のアデニンのメチル化をもたらす。

これに基づき、DamID は Dam を目的のタンパク質 (通常は転写因子などの DNA と相互作用するタンパク質) またはクロマチン成分に融合することから成ります。目的のタンパク質は、Dam をその同族の生体内結合部位に標的化し、隣接する GATC のメチル化を引き起こします。目的のタンパク質の結合部位と一致する m6A の存在は、メチル PCRによって明らかにされます。

メチルPCR

このアッセイでは、ゲノムはDpnIによって消化され、メチル化された GATC のみを切断します。次に、既知の配列を持つ二本鎖アダプターが、DpnI によって生成された末端に連結されます。連結産物は、次にDpnIIによって消化されます。この酵素は、メチル化されていない GATC を切断し、連続するメチル化された GATCに挟まれた断片のみが後続の PCR で増幅されるようにします。次に、アダプターに一致するプライマーを使用した PCR が実行され、メチル化された GATC に挟まれたゲノム断片が特異的に増幅されます。

DamIDとクロマチン免疫沈降法の特異性

クロマチン免疫沈降法(ChIP) は、ゲノムの特定の部位におけるタンパク質結合を分析する代替方法です。ChIP とは異なり、DamID では、対象のタンパク質に対する特定の抗体は必要ありません。一方で、これにより、そのような抗体が利用できないタンパク質をマッピングできます。他方では、翻訳後に修飾されたタンパク質を具体的にマッピングすることは不可能になります。

もう 1 つの基本的な違いは、ChIP は特定の時点での目的のタンパク質の位置をアッセイするのに対し、DamID は目的のタンパク質がどこにあったかアッセイすることです。その理由は、Dam 融合タンパク質がなくなった後も m6A は DNA 内に残るからです。標的部位に結合しているタンパク質や結合していないタンパク質の場合、これは全体像に変化をもたらしません。ただし、DNA に沿って移動するタンパク質 ( RNA ポリメラーゼ など) の場合は、大きな違いが生じる可能性があります。

既知の偏見と技術的な問題

プラスミドメチル化バイアス

実験の実施方法によっては、DamID はプラスミドのメチル化バイアスの影響を受ける可能性があります。プラスミドは通常、 Dam が自然に発現する大腸菌で増幅されるため、すべての GATC でメチル化されます。一過性トランスフェクション実験では、これらのプラスミドの DNA はトランスフェクトされた細胞の DNA とともに回収されます。つまり、プラスミドの断片がメチル PCR で増幅されるということです。したがって、プラスミドと相同性または同一性を共有するゲノムのすべての配列は、対象のタンパク質によって結合されているように見える場合があります。特に、これは対象のタンパク質のオープンリーディングフレームに当てはまり、これはプラスミドとゲノムの両方に存在します。マイクロアレイ実験では、このバイアスを使用して、適切な材料がハイブリダイズされたことを確認できます。安定した細胞株または完全にトランスジェニックな動物では、プラスミド DNA が回収されないため、このバイアスは観察されません。

アポトーシス

アポトーシス細胞は、特徴的なヌクレオソームラダーパターンで DNA を分解します。これにより、DamID 手順中に連結および増幅できる DNA フラグメントが生成されます (van Steensel 研究室、未発表の観察)。これらのヌクレオソームフラグメントがタンパク質の結合プロファイルに及ぼす影響は不明です。

解決

DamID の解像度は、ゲノム内の GATC 配列の可用性に依存します。タンパク質は、連続する 2 つの GATC サイト内にのみマッピングできます。GATC フラグメント間の平均間隔は、ショウジョウバエ (FlyBase リリース 5) では 205 bp、マウス (Mm9) では 260 bp、ヒト (HG19) では 460 bp です。m6Aの免疫沈降と、ターゲットサイト認識の特異性が低い Dam バリアントを組み合わせた修正プロトコル (DamIP) を使用すると、より高解像度のデータを取得できます。^[5]

細胞タイプ別の方法

ChIP seq と比較した DamID の主な利点は、細胞のサブポピュレーションを物理的に分離することなく、特定の細胞タイプでタンパク質結合部位のプロファイリングを生体内で分析できることです。これにより、動物モデルにおける発達プロセスや生理学的プロセスの調査が可能になります。

ターゲットDamID

標的 DamID (TaDa) アプローチは、リボソーム再開始現象を利用して、DamID に適切な低レベルで Dam 融合タンパク質を発現します (つまり、Dam は非飽和であるため、毒性を回避します)。このコンストラクトは、細胞タイプ特異的プロモーターと組み合わせることができ、組織特異的メチル化をもたらします。^[6]^[7]このアプローチは、対象の細胞タイプでの転写因子結合をアッセイするために使用できます。または、dam をPol IIサブユニットに融合して RNA ポリメラーゼの結合を決定し、細胞特異的遺伝子発現を推測することもできます。標的 DamID は、ショウジョウバエとマウス^[8]^[9]細胞で実証されています。

FRT/FLP アウト DamID

細胞特異的な DamID は、Dam 融合タンパク質の上流にある転写終結カセットの組換えによる切除によっても達成できます。 ^{[10]終結カセットは FRT 組換え部位に挟まれており、}FLP 組換え酵素の組織特異的発現と組み合わせることで除去できます。カセットを除去すると、Dam 融合は基礎プロモーターの制御下で低レベルで発現します。

バリエーション

標準的なタンパク質-DNA相互作用の検出だけでなく、DamID はクロマチン生物学の他の側面を調査するためにも使用できます。

スプリットダムID

この方法は、2つの因子が同じゲノム遺伝子座に結合するのを検出するために使用できます。Damメチラーゼは、2つの半分に分かれて発現し、それぞれが異なるタンパク質に融合されます。両方のタンパク質がDNAの同じ領域に結合すると、Dam酵素が再構成され、周囲のGATC部位をメチル化できるようになります。^[11]

クロマチンアクセシビリティ

酵素の活性が高いため、untethered Damの発現はアクセス可能なクロマチンのすべての領域をメチル化します。^[12]^{[13]このアプローチは、}ATAC-seqまたはDNAseqの代替として使用できます。細胞タイプ固有のDamID法と組み合わせると、untethered Damの発現を使用して、細胞タイプ固有のプロモーターまたはエンハンサー領域を識別できます。

RNA-DNA相互作用

RNA-DamIDとして知られるDamIDバリアントは、RNA分子とDNA間の相互作用を検出するために使用できます。^{[14]この方法は、}MS2ステムループで修飾されたRNAに結合できるDam-MCP融合タンパク質の発現に依存しています。Dam融合タンパク質がRNAに結合すると、ゲノムへのRNA結合部位で検出可能なメチル化が発生します。

長期にわたる規制の相互作用

タンパク質結合部位から遠位のDNA配列は、染色体のループによって物理的に近接することがある。例えば、このような相互作用はエンハンサーとプロモーターの機能を媒介する。これらの相互作用は、Damメチル化の作用によって検出することができる。Damが特定の既知のDNA遺伝子座を標的とする場合、DNAの3D構成によって近接する遠位部位もメチル化され、従来のDamIDと同様に検出することができる。^[15]

単一細胞 DamID

DamIDは通常、約10,000個の細胞に対して実行されます^[16]（ただし、より少ない数で実証されています^[6]）。つまり、得られたデータは、その細胞集団全体の平均結合、または結合イベントの確率を表します。単一細胞用のDamIDプロトコルも開発され、ヒト細胞に適用されています^[17] 。単一細胞アプローチは、細胞間のクロマチン関連の異質性を強調することができます。

参考文献

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さらに読む

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外部リンク

DamIDに関するよくある質問

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