MS2 タグ付け

MS2タグ付けは、MS2バクテリオファージコートタンパク質とファージゲノムのステムループ構造との自然な相互作用に基づく技術であり、^[1]RNA-タンパク質複合体の生化学的精製に使用され、生細胞内のRNAの検出のためにGFPと組み合わせられます。 ^[2] 最近では、この技術は、転写部位で生細胞内のRNAの出現をモニターするために、または単に細胞質内のRNA数の変化を観察するために使用されています。^[3]^[4] これにより、原核生物と真核生物の両方の遺伝子の転写が不連続に発生し、不規則な間隔で区切られた転写のバーストが発生することが明らかになりました。

手順

一本鎖RNAから始めて、MS2 RNA結合配列のコピーを非コード領域に追加することで、ステムループ構造のパターンを作成します。^[5] MS2タンパク質はGFPと融合し、MS2のRNA結合配列のコピーを含む複合体であるmRNAに結合する必要があります。^[5] MS2-GFP融合タンパク質は、プラスミド^{[5] （ロバート・シンガーの研究室）を使用して細胞に移すことで発現しました。RNA内でコード化されたシグナルと、GFP-MS2内の}核局在シグナル（NLS）のシグナル存在は、EGFP-MS2-RNA複合体から導入される2つのシグナルです。^[6]

MS2ビオチンタグ付きRNAアフィニティー精製（MS2-BioTRAP）は、タンパク質-RNA相互作用を同定する生体内方法の1つです。^[7] MS2タグ付きRNAとMS2タンパク質タグの両方が発現され、その後、アフィニティー相互作用がタンパク質-RNA相互作用の同定プロセスを支援するために使用されました。^[7]

利点と欠点

利点:

MS2-BioTRAP法は高速かつ柔軟でセットアップが簡単で、拡張性に優れ、タンパク質-RNA相互作用の生理学的条件の研究を可能にします。^[7] MS2タグは、MS2コートタンパク質を使用してさまざまなリボ核タンパク質粒子（RNP）を分離する場合、小分子にも効果的です。^[8]

デメリット:

MS2 タグ付けの注意点の 1 つは、核内の 1 つの RNA 分子を観察および追跡するのに十分な信号を生成するために、RNA 内の MS2 ステムループのコピーを多数追加する必要があることです。 ^[5]培養細胞の核内で複数の RNA 配列を追跡する場合、複数のターゲット配列が必要です。^[5]これは、古典的な基本的な核局在化シグナル(NLS) を持つ MS2 タンパク質の影響を受ける可能性があるため、RNA 複合体の位置に影響を与える可能性があり、核には GFP-MS2 の大部分が存在することになります^[5] (Robert Singer の研究室)。^[6]核内での GFP-MS2 の蓄積は、強い核蛍光シグナルをもたらし、スプライシング、RNA 編集、RNA の核輸出、および RNA 翻訳の分析を妨げるため、RNA の核局在の分析が遅れたり妨げられたりします。^[6]さらに、タグの追加により、RNA の二次構造にアーティファクトが発生する可能性があります。^[5]

さらに、小さな非コードRNA（sRNA）の発現レベルと制御特性は、MS2タグによって影響を受ける。^[8]また、MS2をアフィニティータグとして使用して大腸菌のタンパク質を精製することにより、科学者は、マルトース結合タンパク質と融合した変異を持つMS2コートタンパク質であるMS2-MBPを発現した。この変異はオリゴマー化を防止した。^[8]

参考文献

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[:3-7] Marchese D, de Groot NS, Lorenzo Gotor N, Livi CM, Tartaglia GG (2016年11月). 「RNA結合タンパク質の特性評価における進歩」. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA . 7 (6): 793–810. doi :10.1002/wrna.1378. PMC 5113702. PMID 27503141 .

[:23-8] Said N、Rieder R、Hurwitz R、Deckert J、Urlaub H、Vogel J (2009 年 11 月)。「アプタマータグ付き小型 RNA 調節因子の生体内発現および精製」。核酸研究。37 ( 20 ) : e133。doi :10.1093/nar/gkp719。PMC 2777422。PMID 19726584。