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DNAの再複製（または単に再複製）は、真核細胞において細胞周期ごとにゲノムが複数回複製される望ましくない、場合によっては致命的な現象である。[1]再複製はゲノム不安定性 につながると考えられており、さまざまなヒトの癌の病理に関係している。[2]再複製を防ぐために、真核細胞は、特定の細胞周期で染色体DNAが部分的または完全に再複製されるのを防ぐための複数の重複するメカニズムを発達させてきた。これらの制御メカニズムは、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の活性に依存している。[1] DNA複製制御メカニズムは協力して、複製起点の再ライセンスを防ぎ、細胞周期とDNA損傷チェックポイントを活性化する。[2]ゲノム情報が次の世代に忠実に伝達されるようにするには、DNAの再複製を厳密に制御する必要がある。
起源での複製の開始
DNA の複製は常に複製起点から始まります。酵母では、複製起点には自律複製配列 (ARS) が含まれており、互いに約 30 kb 離れた染色体全体に分布しています。これらは、どこに配置されていても DNA の複製を可能にします。それぞれの長さは 100 ～ 200 bp で、A 要素は最も保存されている範囲の 1 つです。他の保存されている B 要素とともに、複製起点認識複合体(ORC) が集まって複製を開始するセクションを形成します。これらの配列の繰り返しは、おそらく複製起点認識にとって最も重要なものです。
動物細胞では、複製起点は染色体全体にランダムに配置され、ARS として機能することもあるようですが、複製が行われる場所を決定する上で、局所的なクロマチン構造が大きな役割を果たしています。複製起点は染色体全体に均等に分布しているわけではありません。レプリコン クラスターは、クラスターごとに 20 ～ 80 個の起点を含み、S 期に同時に活性化されます。これらはすべて S 期に活性化されますが、ヘテロクロマチンはユークロマチンよりもアクセスが難しいため、S 期後期に複製される傾向があります。エピジェネティック因子も、何がいつ複製されるかに大きな影響を与えます。[3]
Originライセンス
真核生物における DNA の再複製を防ぐ既知のメカニズムはすべて、複製起点ライセンスを阻害します。[1]複製起点ライセンスは、 G1期後期から S 期初期にかけての正常な複製開始の準備段階で、複製前複合体(pre-RC)を複製起点にリクルートします。ライセンスは、マルチサブユニットATPaseである複製起点認識複合体( ORC) が複製起点の DNA に結合することで始まります。[4]クロマチンに結合すると、ORC はAAA+ ATPase Cdc6とコイルドコイルドメインタンパク質Cdt1をリクルートします。Cdt1 の結合と ORC および Cdc6 の ATPase 活性により、 ミニ染色体維持(MCM) タンパク質 2-7 がクロマチンにロードされます。[1] MCM 複合体は、複製起点のヘリックスを開き、複製フォークがDNA に沿って移動する際に 2 本の鎖をほどくDNA ヘリカーゼです。[5] G1期末のCDK活性の上昇は、複製起点の発火とpre-RCの解体を引き起こす。有糸分裂の終わりまで維持される高レベルのCDKは、pre-RC成分を阻害または破壊し、複製起点の再ライセンスを妨げる。有糸分裂の終わりにCDK活性が低下してpre-RCサブユニットが再活性化されるまで、新しいMCM複合体は複製起点にロードできない。このように、CDKは真核生物のDNA複製の制御において二重の役割を果たしている。CDK活性の上昇は複製起点での複製を開始し、複製起点の再ライセンスを阻害することで再複製を防ぐ。[6] [7] [8] これにより、同じ細胞周期で複製起点が2度発火することがなくなる。[5]
DNA複製制御の2状態モデル
DNA複製の調節に関する初期の実験的証拠は、複製起点が細胞周期中の2つの状態のいずれかに存在することを示唆している。すなわち、G1における複製前状態と、開始の瞬間から有糸分裂を通過するまでの複製後状態である。 [1] 複製起点は、細胞周期中にこれら2つの異なる状態を交互に繰り返す。[9]複製開始に必要なライセンス因子は 、複製前状態の起点に結合する。G1 /S遷移では、因子は不活性化され、細胞周期が終了するまで回復できない。[10] ORC、Cdc6、Cdt1、およびMCM複合タンパク質がライセンス因子として特定され、特徴付けられたことは、このモデルに信憑性を与え、細胞周期におけるCDKの振動特性が再複製を調節できる手段を示唆している。[1]
複製制御
出芽酵母
再複製の制御は出芽酵母で最もよく理解されている。 サッカロミセス・セレビシエ細胞は、プレRC構成要素Cdc6、MCM2-7、およびORCサブユニットのCDK媒介リン酸化を介してプレRCアセンブリを直接制御することで再複製を防ぐ。 [5] これらの構成要素のリン酸化はS期の開始時に開始され、CDK活性が高いままである限り、細胞周期の残りの期間を通じて維持される。リン酸化Cdc6はユビキチンタンパク質リガーゼSCFに結合し、タンパク質分解を引き起こす。MCM2-7タンパク質のCDK依存性リン酸化は、複合体の核からの輸出をもたらす。（MCM複合体と関連するCdt1も同様に核から輸出される）。ORCサブユニットのリン酸化は、おそらくORCの他のプレRC構成要素への結合能力を破壊する。[5] このように、複数のメカニズムにより、pre-RCが複製後起源上で再構成されないことが保証されます。
注:起点は S 期を通じて異なるタイミングで発火するため、新しい MCM2-7 のリクルートメントを阻止する阻害メカニズムが既存の pre-RC を不安定化させないことが重要です。再複製阻害メカニズムが pre-RC コンポーネントを阻害または破壊している場合でも、発火していない起点に pre-RC が組み立てられたままになることがあります。
その他の生物
CDKによるpre-RCアセンブリの調節は進化的に高度に保存されているように見えるが、生物間で若干の違いが認められる。多細胞真核生物では、pre-RCアセンブリはCDKに加えて後期促進複合体（APC）によっても調節される。E3酵素であるAPCは、タンパク質ジェミニンをユビキチン化し、それを分解の標的とする。[5] ジェミニンは通常、Cdt1に結合して阻害することで起点のライセンス付与を防ぐ。G1では、APCの活性はジェミニンの蓄積を抑制するのに十分であり、それによって間接的にpre-RCアセンブリを促進する。G1の終わりに、APCは不活性化され、ジェミニンが蓄積して起点の再ライセンス付与を防ぐことができる。
Cdt1 は通常、E2F を介した転写活性化とヒトアセチラーゼの Orc1 への結合によってアップレギュレーションされます。Cdt1 のタンパク質分解は、さまざまな高等真核生物でも保存されているメカニズムです。Cdt1 は Cul4–Ddb1–Cdt2 E3 ユビキチンリガーゼ複合体によって分解されるため、S 期と G2 期で DNA ライセンス制御が維持されます。Cdt1 は重要な調節タンパク質であり、進化によりさまざまな生物で異なる調節経路が生まれました。Cdt1 の過剰発現または Geminin の不活性化は再複製につながる可能性があり、分解されていない Cdt1 は pre-RC アセンブリを誘導します。[11]
ほとんどの動物におけるプレRC調節はまだ十分に理解されていない。[5]
真核細胞における再複製の結果
再複製と有糸分裂の失敗は、一般的にプログラムされたイベントではなく、細胞周期機構の欠陥によって自然に発生します。[1]再複製はdsDNAの切断を引き起こし、DNA損傷反応を引き起こし、細胞をG2で停止させます。[12] チェックポイントは、実質的に永久的な細胞周期停止と最終的なアポトーシスを引き起こします。[13]
再複製は、起源の再ライセンスを妨げるメカニズムのいくつかを同時に破壊することによって実験的に誘導することができます。たとえば、ORC、MCM2-7、Cdc6メカニズムの調節解除は、出芽酵母細胞の再複製を誘導することができます。[14]
注：最近の証拠は、重複しているものの、複数の複製制御メカニズムを機能的に冗長であると見なすべきではないことを示唆している。単一のメカニズムは99％以上の効率で再複製を抑制できるかもしれないが、多くの世代にわたってゲノムの安定性を維持するのに十分ではない可能性がある。 [15]むしろ、多くの重複するメカニズムの相乗効果によって再複製が十分に防止され、細胞のゲノムが忠実に伝達されると信じられている[誰が？ ]。
再複製の防止
複製ストレスを受けた細胞は複製チェックポイントを活性化し、S期を遅らせ、G2/M期への移行を遅くします。複製ストレスがU-2-OS細胞、野生型網膜芽細胞腫（RB）およびp53を有するヒト骨肉腫細胞株によって認識されると、ATM/ATR制御DNA損傷ネットワークが活性化されます。[16] このチェックポイント応答は、ライセンスシステムの制御に重要であることが示されているサイクリンEの過剰発現により活性化されます。[17] U-2-OS細胞株でサイクリンEが過剰発現すると、ATM/ATR制御DNA損傷ネットワークにより、Ser 15リン酸化p53、γ-H2AX、およびSer 966リン酸化コヒーシンSMC1が増加します。[16] DNA再複製応答は、損傷が酸素ラジカル生成によるものである場合にとられる応答とは異なります。酸素ラジカル生成によるダメージはMyc癌遺伝子の反応を引き起こし、p53とH2AXをリン酸化します。[16]
ATM/ATR DNA 損傷ネットワークは、Cdt1 の過剰発現がある場合にも反応します。Cdt1 の過剰発現は、ssDNA と DSB の蓄積につながります。Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) は、DNA 再複製の初期段階で ssDNA を検出すると、より早く活性化されます。ATR は、RPA2 や MCM2 などの下流の複製因子をリン酸化するか、Rb または p53 の調節を介してリン酸化します。Ataxia telangiectasia mutated (ATM) は、DNA 再複製の後期段階で大量の DSB が検出されると活性化します。ATM は細胞周期停止、アポトーシス、老化に役割を果たしますが、DSB 修復の媒介にも役割を果たしていると考えられていますが、正確なメカニズムはまだわかっていません。[11]
がんにおける再複製
再複製はモデル生物およびヒトの腫瘍形成に関与していることが示唆されている。複製開始タンパク質は数種類のヒト癌の組織サンプルで過剰発現しており[1] [18] [19]、Cdt1およびCdc6の実験的過剰発現はマウス細胞で腫瘍の発生を引き起こす可能性がある。 [20] [21] [22]同様に、ノックアウトマウスにおけるジェミニンの除去は腫瘍形成を促進することが報告されている。[23]さらに、これらの研究は再複製が異数性、染色体融合、およびDNA切断の増加につながる可能性があることを示唆している。 [24] 制御複製メカニズムの徹底的な理解は、新しい癌治療法の開発に重要である。
酵母では、G1 CDK 活性の増加により、通常、pre-RC の組み立てと活性の低い起点による S 期への移行が阻害されますが、癌細胞では、p53 および Rb/E2F 経路が調節解除され、活性起点の量が減少した状態で S 期への移行が可能になります。これにより、DNA の二重鎖切断、組み換えの増加、および染色体の誤った配置が発生します。この損傷が発生するメカニズムはまだわかっていません。1 つの可能性として、起点の活性化の低下により DNA 複製が不完全になるというものがあります。すべての CDK 調節経路が阻害された場合にのみ、大幅な再複製が観察されます。[25]
哺乳類細胞では、Cdt1 と Cdc6 は再複製制御にとってはるかに重要である。[25] Cdt1 と Cdc6 の過剰発現は、非小細胞肺癌の 75 例中 43 例で確認された。[11]哺乳類細胞で Cdc6 または ORC を標的にしても、大幅な再複製は引き起こされない。一方、Cdt1 の過剰発現は、それ自体で潜在的に致命的な再複製レベルにつながる可能性がある。この反応は癌細胞でのみ見られる。[25] E2F ファミリー メンバーの過剰発現は、Cdt1 および Cdc6 の発現の増加に寄与する。細胞における p53 制御の喪失は、Cdt1 または Cdc6 を過剰発現する細胞株で頻繁に観察される。[11]
エンドリデュプリケーション
細胞周期によって制御される DNA 複製の特殊なケース、つまり DNA 合成が細胞周期の進行から切り離されている場合については、エンドリデュプリケーションを参照してください。エンドリデュプリケーションは、多くの細胞タイプで重要かつ広く普及しているメカニズムです。これは、定期的に分裂する細胞の多くの細胞周期チェックポイントやダメージコントロールには従いませんが、制御されていない再複製にはつながりません。エンドリデュプリケーションは制御されたプロセスであり、特定の細胞機能を実行するために発生します。一部の細胞では、エンドリデュプリケーションは胚形成と発芽のためのヌクレオチドを貯蔵する方法として使用されていると提案されています。他のケースでは、エンドリデュプリケーションは栄養素の貯蔵のためだけに使用されている細胞で使用されている可能性があります。多くの細胞で有用な機能を果たすにもかかわらず、エンドリデュプリケーションは癌細胞でも観察されており、エンドリデュプリケーションが癌の行動につながるのか、それとも他の突然変異がエンドリデュプリケーションにつながるのかは完全にはわかっていません。他のメカニズムがこれらの変化を媒介している可能性があります。[26]
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