免疫沈降法

免疫沈降法( IP ) は、特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して、溶液からタンパク質抗原を沈殿させる技術です。このプロセスは、何千もの異なるタンパク質を含むサンプルから特定のタンパク質を分離して濃縮するために使用できます。免疫沈降法では、手順のどこかの時点で 抗体を固体基質に結合する必要があります。

既知のタンパク質に特異的な抗体を使用して、さまざまなタンパク質を含む溶液から特定のタンパク質を分離します。これらの溶液は、多くの場合、植物または動物組織の粗溶解物の形をとります。その他のサンプルの種類としては、体液や生物由来のその他のサンプルがあります。

完全なタンパク質複合体（抗原とそれに結合したタンパク質またはリガンド）の免疫沈降は、共免疫沈降（Co-IP）として知られています。Co-IP は、より大きなタンパク質複合体のメンバーであると考えられる既知のタンパク質を標的とする抗体を選択することで機能します。この既知のメンバーを抗体で標的とすることで、タンパク質複合体全体を溶液から引き出し、複合体の未知のメンバーを特定できるようになります。

これは、複合体に含まれるタンパク質が互いにしっかりと結合し、抗体で複合体の 1 つのメンバーに引っかかることで複合体の複数のメンバーを溶液から引き出すことができる場合に機能します。タンパク質複合体を溶液から引き出すこの概念は、「プルダウン」と呼ばれることもあります。Co-IP は、分子生物学者がタンパク質間相互作用を分析するために定期的に使用する強力な手法です。

• 特定の抗体は、エピトープが露出している標的タンパク質のサブポピュレーションを選択することが多く、そのため、エピトープが隠れている複合体内のタンパク質を識別できません。これは、抗体を大量に使用した場合であっても、サンプルから特定のタンパク質の半分さえも単一の抗体で沈殿させることがほとんど不可能であることからもわかります。
• 標的化と免疫沈降が連続的に行われると、特定されたタンパク質の数は増え続ける可能性があります。特定されたタンパク質は、特定の時点で単一の複合体として存在するわけではなく、異なる目的で異なる時点で相互に作用するタンパク質のネットワークを表す場合があります。
• タンパク質複合体の異なるメンバーをターゲットにして実験を繰り返すことで、研究者は結果を再確認することができます。プルダウンの各ラウンドで、元の既知のタンパク質と、以前に特定された複合体の他のメンバー (および新しい追加メンバー) の両方が回復されるはずです。このように免疫沈降を繰り返すことで、研究者はタンパク質複合体の特定された各メンバーが有効に特定されたことを確認します。特定のタンパク質が、既知のメンバーの 1 つをターゲットにすることによってのみ回復され、他の既知のメンバーをターゲットにすることによって回復されない場合、そのタンパク質が複合体のメンバーであるかどうかは疑問視される可能性があります。

クロマチン免疫沈降法(ChIP) は、特定のタンパク質のゲノム上のDNA結合部位 の位置を決定するために使用される方法です。この技術により、生きた細胞または組織の核内で発生するタンパク質と DNA の相互作用の図が得られます。この方法のin vivo の性質は、同じ質問に答えるために従来から使用されている他のアプローチとは対照的です。

このアッセイの原理は、生細胞内のDNA 結合タンパク質 (転写因子やヒストンを含む) は、結合している DNA に架橋できるというものです。推定 DNA 結合タンパク質に特異的な抗体を使用することで、細胞溶解物からタンパク質-DNA 複合体を免疫沈降させることができます。架橋は、多くの場合、細胞 (または組織) にホルムアルデヒドを塗布することによって行われますが、ジメチル 3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート-2 HCl (DTBP) などのより明確で一貫性のある架橋剤を使用する方が有利な場合もあります。^[1]架橋後、細胞を溶解し、DNA を超音波処理によって 0.2～1.0 kb の長さに切断します。この時点で免疫沈降が行われ、タンパク質-DNA 複合体が精製されます。精製されたタンパク質-DNA 複合体は、タンパク質と DNA 複合体のホルムアルデヒド架橋を逆転させるために加熱され、DNA をタンパク質から分離することができます。単離された DNA 断片の同一性と量は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって決定できます。単離された断片に対して PCR を実行する際の制限は、正しい PCR プライマーを生成するために、どのゲノム領域がターゲットになっているかを把握していなければならないことです。この制限は、単離されたゲノム DNA をプラスミドベクターにクローニングし、そのベクターのクローニング領域に固有のプライマーを使用するだけで回避できる場合があります。あるいは、タンパク質がゲノム全体にわたって結合する場所を見つけたい場合は、ChIP シーケンシングが使用されます。これは、タンパク質結合部位を高スループットでコスト効率の高い方法で特定できる標準技術として最近登場しており、シストロムの特性評価も可能になっています。以前は、DNA マイクロアレイも使用されていました ( ChIP-on-chip または ChIP-chip )。

RIPとCLIPはどちらも特定のRNA結合タンパク質を精製して結合したRNAを同定し、それによってリボ核タンパク質（RNP）を研究する。^{[2] [3]} RIPでは、共精製されたRNAが抽出され、その濃縮度が対照と比較されるが、これはもともとマイクロアレイまたはRT-PCRによって行われていた。CLIPでは、細胞は溶解前にUV架橋され、その後、標準的な免疫沈降法を超えた追加の精製ステップが続き、これには部分的なRNA断片化、高塩洗浄、SDS-PAGE分離および膜転写、cDNAシーケンシングによる直接RNA結合部位の同定が含まれる。

免疫沈降法における大きな技術的ハードルの 1 つは、既知のタンパク質を 1 つだけ特異的に標的とする抗体を生成するのが非常に難しいことです。この障害を回避するために、多くのグループが、対象のタンパク質の C 末端または N 末端にタグを組み込んでいます。この場合の利点は、同じタグをさまざまなタンパク質に何度も使用でき、研究者は毎回同じ抗体を使用できることです。タグ付きタンパク質を使用する利点は非常に大きいため、この手法は、上で詳述したすべての種類の IP を含むすべての種類の免疫沈降法で一般的になっています。使用されているタグの例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP) タグ、グルタチオン S トランスフェラーゼ(GST) タグ、FLAG タグタグなどがあります。プルダウンを可能にするタグの使用は便利ですが、タグ自体が本来の相互作用を不明瞭にしたり、新しい不自然な相互作用を導入したりする可能性があるため、生物学的関連性に関する懸念が生じます。

免疫沈降の一般的な 2 つの方法は、直接捕捉法と間接捕捉法です。

特定のタンパク質（またはタンパク質のグループ）に特異的な抗体は、超常磁性 マイクロビーズなどの固相基質または微細アガロース（非磁性）ビーズ上に固定化されます。次に、抗体が結合したビーズをタンパク質混合物に加えると、抗体の標的となるタンパク質が抗体を介してビーズ上に捕捉されます。つまり、免疫沈降されます。

特定のタンパク質またはタンパク質のグループに特異的な抗体は、タンパク質の混合物に直接追加されます。抗体はまだ固相支持体に付着していません。抗体はタンパク質混合物の周りを自由に浮遊し、ターゲットに結合します。時間が経つにつれて、プロテイン A/Gでコーティングされたビーズが抗体とタンパク質の混合物に追加されます。この時点で、ターゲットに結合した抗体はビーズに付着します。

この時点で、サンプルの成分が同じになったため、直接プロトコルと間接プロトコルは収束します。どちらの方法でも、ビーズに固定された抗体に結合したタンパク質またはタンパク質複合体によって、同じ最終結果が得られます。

間接的なアプローチは、タンパク質ターゲットの濃度が低い場合や、タンパク質に対する抗体の特異的親和性が弱い場合に好まれることがあります。間接的な方法は、さまざまな理由により抗体のタンパク質への結合速度が遅い場合にも使用されます。ほとんどの場合、直接的な方法がデフォルトであり、好ましい選択肢です。

歴史的に、大多数の科学者が免疫沈降法に使用している固相支持体は、多孔性アガロースビーズ（アガロース樹脂またはスラリーとも呼ばれる）です。この技術の利点は、アガロース粒子のスポンジ状構造のほぼ全体（サイズ 50 ～ 150 μm）が抗体（次に標的タンパク質に結合）の結合に使用できるため、非常に高い結合能力が期待できることと、特別な装置を必要とせずに IP プロトコルのすべての側面に標準的な実験装置を使用できることです。極めて高い結合能力の利点は、研究者がアガロースビーズをコーティングするために使用する抗体の量と慎重にバランスを取る必要があります。抗体はコストを制限する要因となる可能性があるため、捕捉する必要があるタンパク質の量 (下流で実行される分析によって異なります)から、その量のタンパク質を結合するために必要な抗体の量(システムの非効率性を考慮して少し余分に追加)、さらにその特定の量の抗体を結合するために必要なアガロースの量まで逆算するのが最善です。抗体の飽和が必要ない場合、この技術は捕捉したターゲット タンパク質を非常に大量に捕捉する能力において他に類を見ません。ここでの注意点は、「高容量の利点」が「高容量の欠点」になる可能性があることです。これは、セファロース/アガロース ビーズの膨大な結合能力が抗体で完全に飽和していない場合に現れます。研究者が免疫沈降実験に使用できる抗体の量が、免疫沈降で使用するアガロース ビーズを飽和させるのに十分ではないことがよくあります。このような場合、研究者は抗体で部分的にしかコーティングされていないアガロース粒子を得ることになり、抗体でコーティングされていないアガロースビーズの結合能力の部分は、付着するものなら何でも自由に結合し、溶解物成分がビーズに非特異的に結合するためバックグラウンド信号が上昇し、データの解釈が困難になる可能性があります。これらの理由から、アガロースの量（結合能力の観点から）を免疫沈降のために結合させたい抗体の量に合わせるのが良いと主張する人もいるかもしれませんが、アガロースビーズへの非特異的結合の問題を減らして特異性を高める簡単な方法は、溶解物を事前にクリアすることであり、これはあらゆる免疫沈降に強く推奨されます。^{[4] [5]}

ライセートはタンパク質、脂質、炭水化物、核酸の複雑な混合物であり、IP 抗体、プロテイン A/G、またはビーズ支持体への非特異的結合がいくらか発生し、免疫沈降したターゲットの検出に悪影響を与えると想定する必要があります。ほとんどの場合、各免疫沈降実験の開始時にライセートを事前クリアリングする(以下の「プロトコル」セクションの手順 2 を参照) ^[6]ことは、免疫沈降の前に細胞ライセートから潜在的に反応性のある成分を除去し、これらの成分が IP ビーズまたは抗体に非特異的に結合するのを防ぐ方法です。基本的な事前クリアリング手順を以下に説明します。この手順では、ライセートをビーズのみでインキュベートし、免疫沈降の前にビーズを除去して廃棄します。^[6]ただし、このアプローチでは、IP 抗体への非特異的結合が考慮されていません。非特異的結合は相当な量になる可能性があります。したがって、プレクリアリングの代替方法としては、IP抗体自体の代わりに、IP抗体と同じ抗体サブクラスの非標的無関係な抗体を使用することを除いて、免疫沈降で使用するのとまったく同じ成分でタンパク質混合物をインキュベートする方法があります。^[5]このアプローチは、実際の免疫沈降とできるだけ正確に同じIP条件と成分を使用して、標的タンパク質を捕捉することなく非特異的な細胞成分を除去しようとします（もちろん、標的タンパク質が他のIP成分に非特異的に結合する場合を除きます。これは、溶解物のプレクリアリングに使用した廃棄ビーズを分析することによって適切に制御する必要があります）。その後、非特異的結合がデータ解釈を妨げるリスクを減らして、標的タンパク質を免疫沈降することができます。

免疫沈降法の大半はアガロースビーズで行われますが、超常磁性ビーズを免疫沈降に使用することは、IP アプリケーションにおけるアガロースビーズの代替として人気が高まっている新しいアプローチです。アガロースとは異なり、磁性ビーズは固体で、ビーズの種類によっては球形になることもあり、抗体の結合は各ビーズの表面に限定されます。これらのビーズには結合容量を増やすための多孔質中心の利点はありませんが、磁性ビーズはアガロースビーズよりも大幅に小さく (1 ～ 4 μm)、アガロースビーズよりも体積あたりの磁性ビーズの数が多いため、磁性ビーズは抗体結合を最適化するための効果的な表面積対体積比を備えています。

市販の磁性ビーズは、サイズの均一性に基づいて単分散ビーズと多分散ビーズに分けられます。単分散ビーズはマイクロビーズとも呼ばれ、完全に均一であるため、すべてのビーズは結合能力や磁石への吸引力など、同一の物理的特性を示します。多分散ビーズは、単分散ビーズとサイズは似ていますが、結合能力や磁気捕捉に影響を与える可能性がある幅広いサイズのばらつき（1～4 μm）を示します。どちらのタイプのビーズも免疫沈降用途に市販されていますが、高品質の単分散超常磁性ビーズは、サイズ、形状、性能が一貫しているため、自動プロトコルに適しています。単分散および多分散超常磁性ビーズは、Invitrogen、Thermo Scientific、Milliporeなど多くの企業から提供されています。

磁気ビーズの支持者は、標準的なアガロースビーズベースの免疫沈降は1時間で行われているが、免疫沈降用途ではアガロースビーズよりも磁気ビーズの方がタンパク質結合速度が速いと主張している[7] [8] [9]。^{[ 5 ]また}、磁気ビーズはそのような複合体のサイズの上限がまったくないため、非常に大きなタンパク質複合体の免疫沈降に適しているという主張もあるが^{[7] [8] [10]}、この主張を裏付ける公平な証拠はない。磁気ビーズ技術の性質上、アガロースを使用する場合の繰り返しの遠心分離と比較して磁気分離によるサンプルへの物理的ストレスが軽減されるため、サンプルの取り扱いが少なくなり^{[8] 、不安定な（壊れやすい）タンパク質複合体の収量を大幅に増加させるのに貢献する可能性がある。 [8] [9] [10]}ただし、結合容量、試薬のコスト、追加機器の必要性、IPプロセスの自動化機能などの追加要因は、免疫沈降支持体の選択において考慮されるべきである。

アガロースビーズと磁気ビーズの両方を支持する人は、2 つのビーズの結合能力の大きな違いが、特定の種類のビーズに有利であるかどうかを議論することができます。ビーズ同士の比較では、アガロースビーズは、ビーズサイズが大きくスポンジのような構造のため、磁気ビーズよりも表面積が著しく大きく、したがって結合能力も大きくなります。しかし、アガロースの孔サイズが可変であるため、サイズ上限が生じ、非常に大きなタンパク質またはタンパク質複合体の内部結合部位への結合に影響する可能性があります。そのため、磁気ビーズは、アガロースビーズよりも大きなタンパク質またはタンパク質複合体の免疫沈降に適している可能性がありますが、どちらのケースも証明する独立した比較証拠はありません。

アガロースビーズの結合能力は著しく高いが、非特異的結合能力が大きいため不利であると主張する人もいます。また、アガロースビーズの全結合能力を飽和させるために必要な抗体の量が多く、アガロースを使用することの経済的な不利が明らかであるため、磁気ビーズの使用を主張する人もいます。これらの議論は実際の使用状況以外では正しいですが、これらの論理的流れは、アガロースビーズと磁気ビーズのどちらを使用するかの決定が結合能力によって単純に決定されるわけではないことを示す免疫沈降の原理の 2 つの重要な側面を無視しています。

まず、非特異的結合は固定化支持体上の抗体結合部位に限定されません。抗体または免疫沈降反応の成分のどの表面も非特異的溶解物成分に結合する可能性があるため、完全に飽和したビーズを使用した場合でも非特異的結合は発生します。これが、免疫沈降を実行する前にサンプルを事前にクリアすることが重要である理由です。

第二に、標的タンパク質を捕捉する能力は、使用される固定化抗体の量に直接依存するため、アガロースと磁気ビーズ免疫沈降を並べて比較すると、どちらの支持体も捕捉できるタンパク質の最大量は、追加される抗体の量によって制限されます。したがって、このページのアガロース セクションで前述したように、任意のタイプの支持体を飽和させるかどうかの決定は、必要なタンパク質の量によって決まります。

どちらのタイプの支持体を使用する場合も、その価格は免疫沈降アプリケーションにアガロースビーズまたは磁気ビーズを使用するかどうかの重要な決定要因です。一見すると、磁気ビーズとセファロースビーズのコストを比較すると、セファロースビーズの方が安価に思えるかもしれません。しかし、分析規模の免疫沈降では、使用する IP 方法と IP 反応ごとに必要なビーズ量に応じて、磁気ビーズはアガロースに比べて価格競争力がある場合があります。

以下に示す従来のバッチ免疫沈降法では、IP 反応中にすべての成分がチューブに追加されますが、アガロース ビーズの物理的な取り扱い特性により、各 IP 実験で最小量のビーズが必要になります (通常、IP あたり 25 ～ 50 μl ビーズの範囲)。これは、セファロース ビーズを遠心分離によってチューブの底に濃縮し、各インキュベーション、洗浄などの後に上清を除去する必要があるためです。25 ～ 50 μl 未満のアガロース ビーズのペレットは、チューブの底で視覚的に識別することが困難 (不可能ではないにしても) であるため、プロセスに絶対的な物理的制限が課せられます。磁気ビーズでは、磁気的な取り扱いのため必要なビーズの最小量はなく、したがって、ターゲット抗原と IP 抗体によっては、使用する磁気ビーズを大幅に少なくすることができます。

逆に、通常のマイクロチューブの代わりにスピンカラムを使用すると、反応ごとに必要なアガロースビーズの量を大幅に減らすことができます。スピンカラムには、ビーズ以外のすべての IP コンポーネントを短時間の遠心分離で通過させるフィルターが含まれているため、損失を最小限に抑えながら、使用するアガロースビーズを大幅に減らすことができます。

前述のように、免疫沈降法でアガロースビーズを使用する場合は標準的な実験装置のみが必要ですが、磁気ビーズベースの IP 反応には高出力の磁石が必要です。磁気捕捉装置は高額かもしれませんが、磁気ビーズを使用した免疫沈降を迅速に完了することは、助成金の支給期限が迫っている場合には経済的に有利なアプローチとなる可能性があります。なぜなら、磁気ビーズを使用した 30 分間のプロトコルは、アガロースビーズを使用した 4 °C での一晩のインキュベーションと比較して、より短時間でより多くのデータを生成する可能性があるからです。^{[7] [8] [9]}

磁気ビーズを使用するもう 1 つの利点は、自動化された免疫沈降装置がより容易に利用できるようになっていることです。これらの装置は、IP を実行するための作業量と時間を削減するだけでなく、ハイスループットアプリケーションにも使用できます。

磁気ビーズを使用する明らかな利点としては、反応速度の向上、より穏やかなサンプル処理、自動化の可能性などがありますが、支持媒体の結合容量と製品のコストに基づいてアガロースまたは磁気ビーズを使用する選択は、対象のタンパク質と使用する IP 方法によって異なります。すべてのアッセイと同様に、特定のアプリケーションに最適な方法を決定するには、経験的なテストが必要です。

固体基質ビーズ技術を選択したら、抗体をビーズに結合させ、抗体でコーティングしたビーズを異種タンパク質サンプル (例: ホモジナイズした組織) に加えます。この時点で、ビーズに固定された抗体は、それらが特異的に認識するタンパク質に結合します。これが起こると、特定の目的のタンパク質が、ビーズに固定された抗体に結合するため、プロトコルの免疫沈降部分は実際に完了します。免疫複合体を溶解物から分離することは、非常に重要な一連の手順です。これは、結合していないタンパク質を除去してバックグラウンドを減らすために、洗浄手順の間、タンパク質は互いに結合したまま (co-IP の場合)、抗体に結合したままでなければならないためです。

アガロースビーズを使用する場合、600～3,000 xg（標準重力倍）の遠心力で短時間遠心分離し、ビーズをサンプルからペレット化する必要があります。この手順は標準的なマイクロ遠心管で実行できますが、より速い分離、より高い一貫性、より高い回収率を得るために、このプロセスは、液体は通過できるがアガロースビーズは通過できない孔径の小さなスピンカラムで実行されることがよくあります。遠心分離後、アガロースビーズはチューブの底で非常に緩いふわふわしたペレットを形成します。汚染物質を含む上清は、ビーズを乱さないように慎重に除去できます。次に、洗浄バッファーをビーズに追加し、混合した後、ビーズを再び遠心分離で分離できます。

超常磁性ビーズの場合、サンプルを磁場内に置くと、ビーズがチューブの側面に集まります。この手順は通常約 30 秒で完了し、残った (不要な) 液体はピペットで除去されます。洗浄は、ビーズを (磁石から) 洗浄液で再懸濁し、次にビーズをチューブの壁に戻して濃縮します (チューブを磁石に戻します)。洗浄は通常、汚染物質を十分に除去するために数回繰り返します。超常磁性ビーズのサイズが均一で、磁石が適切に設計されていれば、ビーズはチューブの側面に均一に濃縮され、洗浄液は簡単かつ完全に除去できます。

洗浄後、沈殿したタンパク質を溶出し、ゲル電気泳動、質量分析、ウェスタンブロッティング、または複合体の成分を識別するための他のさまざまな方法で分析します。免疫沈降のプロトコル時間はさまざまな要因によって大きく異なり、必要な洗浄回数や多孔質アガロースビーズの反応速度が遅いほどプロトコル時間は長くなります。

1. 細胞を溶解し、免疫沈降用のサンプルを準備します。
2. サンプルをビーズのみまたは無関係な抗体に結合したビーズに通して、IP コンポーネントに非特異的に結合するタンパク質を吸収することにより、サンプルを事前にクリアします。
3. 目的のタンパク質に対する抗体を含む溶液をインキュベートします。抗体は、このステップの前 (直接法) またはこのステップの後 (間接法) に固体支持体に付着させることができます。抗体抗原複合体が形成されるようにインキュベーションを続けます。
4. 対象の複合体を沈殿させ、バルク溶液から除去します。
5. 沈殿した複合体を数回洗浄します。アガロース ビーズを使用する場合は、洗浄の合間に毎回スピンし、超常磁性ビーズを使用する場合はチューブを磁石の上に置き、上清を除去します。最後の洗浄後、できるだけ多くの上清を除去します。
6. 低 pH または SDS サンプル ローディング バッファーを使用して、固体支持体からタンパク質を溶出します。
7. 関心のある複合体または抗原を分析します。これはさまざまな方法で実行できます。
   1. SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド ゲル電気泳動）に続いてゲル染色。
   2. SDS-PAGE に続いて、ゲル染色、個々の染色されたタンパク質バンドの切り出し、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析法によるバンド内のタンパク質の配列決定が行われます。
   3. 抗原と相互作用するタンパク質を別の抗体を使用して転写およびウェスタンブロットし、続いて化学発光または蛍光二次抗体を使用して検出します。

• ufl.edu での免疫沈降法を用いたタンパク質の分析
• 米国国立医学図書館医学件名表(MeSH)における免疫沈降
• 米国国立医学図書館の医学主題標目表(MeSH)におけるクロマチン + 免疫沈降
• 免疫沈降法入門

共免疫沈降（Co-IP）技術