架橋免疫沈降

HITS-CLIPは、 UV架橋と免疫沈降をハイスループットシーケンスと、RNA結合タンパク質の結合部位を同定します。 ^{[ 5 ]} HITS-CLIPでは、プライマーにジヌクレオチドバーコードを追加することも導入され、複数の実験を同時にシーケンスしてデコンボリューションすることが可能になりました。 ^{[ 7 ]}高いシーケンス深度での架橋誘発変異部位（CIMS）の解析により、架橋部位を他の配列変異源から区別することができます。 ^{[ 28 ]}

PAR-CLIP（光活性化リボヌクレオシド強化架橋および免疫沈降）は、細胞RNA結合タンパク質（RBP）およびマイクロRNA含有リボヌクレオタンパク質複合体（ miRNP）の結合部位の同定にも使用されます。 ^{[ 25 ]}この方法は、4-チオウリジン（4-SU）や6-チオグアノシン（6-SG）などの光反応性リボヌクレオシド類似体を生細胞が新生RNA転写産物に取り込むことに基づいています。365 nmのUV光で細胞を照射すると、光反応性ヌクレオシド標識細胞RNAと相互作用するRBPとの効率的な架橋が誘導されます。目的のRBPの免疫沈降に続いて、架橋および共免疫沈降したRNAが分離されます。単離されたRNAはcDNAライブラリーに変換され、ハイスループットシーケンス技術を用いて詳細なシーケンス解析が行われる。4-SUおよび6-SGアナログを架橋すると、それぞれチミジンからシチジン、グアノシンからアデノシンへの置換が起こる。その結果、PAR-CLIPは結合部位の位置を高精度で特定することができる。

しかし、PAR-CLIPは主に培養細胞に限定されており、ヌクレオシドの細胞毒性が懸念されています。^{[ 2 ]} 4-SUはリボソームRNA合成を阻害し、核小体ストレス応答を誘導し、細胞増殖を減少させることが報告されています。^{[ 29 ]} PAR-CLIPは、いくつかの既知のRBPおよびマイクロRNAを含むリボ核タンパク質複合体のトランスクリプトーム全体の結合部位を高解像度で決定するために使用されています。これには、AGOおよびTNRC6タンパク質を標的とするmiRNAが含まれます。^{[ 21 ]}

iCLIP（個々のヌクレオチド分解能でのクロスリンクおよび免疫沈降）は、クロスリンク部位で逆転写が途中で停止したときに生成される切断されたcDNAの増幅を可能にするCLIPの変種である。 ^{[ 6 ]}タンパク質-RNAクロスリンク部位を特定する他のアプローチには、 PAR-CLIPにおけるヌクレオチド遷移などの読み飛ばしcDNAの変異解析^{[ 25 ]}、または標準的なHITS-CLIP法で逆転写酵素がクロスリンク部位を読み飛ばすときに導入されるまれなエラー^{（クロスリンク誘導変異部位（CIMS）解析と呼ばれる） [ 30 ]}などがある。

iCLIPでは、逆転写に使用するプライマーに実験用バーコードとともにランダム配列（ユニーク分子識別子、UMI）を追加し、それによってユニークなcDNAにバーコードを付けてPCRのエラーや定量バイアスを最小限に抑え、結合イベントの定量化を改善しました。切断されたcDNAの増幅を可能にすることで、切断されたcDNAの開始位置を分析することによってRNA-タンパク質相互作用部位を高解像度で特定し、「iCount 」と呼ばれるソフトウェアでUMIを使用して正確に定量化しました。iCLIPのこれらの革新は、eCLIPやirCLIPなどの後のCLIPのバリアントに採用されました。^{[ 4 ]} iCLIPのもう1つの改良であるmiCLIPは、変異酵素または修飾特異的抗体を使用してメチル化RNA部位を特定します。^{[ 31 ] [ 32 ] [ 2 ]} iCLIPの定量的性質により、完全なRNAのレベルでサンプル間で比較したり、^{[ 33 ]}複数のRNA結合タンパク質の競合的結合を研究したり、^{[ 34 ]}または結合ピークのレベルで変異タンパク質の結合の微妙な変化を研究したりすることが可能になった。^{[ 35 ]}

eCLIP（強化型クロスリンクおよび免疫沈降法に続いてハイスループットシーケンスを行う）は、RNA上のRBP結合部位をトランスクリプトーム全体でマッピングするためにも使用されます。^{[ 36 ]} eCLIPは、精製されたRNA断片をcDNAライブラリーに変換する効率を高めることでiCLIPを改良するように設計されました。発表当時、eCLIPはこのような効率を1000倍以上向上させると報告されており、PCR重複分子の無駄なシーケンスを減らすだけでなく、CLIP手順中の実験失敗も劇的に減少させます。さらに、eCLIPでの増幅はRNA-seqに匹敵するようになり、ペアの入力コントロールに対する厳密な定量的正規化（リボソームRNAやその他の高存在量のRNAのバックグラウンドを除去するため）と、ピークとサンプル間の定量的比較が可能になり、対立遺伝子特異的結合または条件間の異なるRNA結合を検出する能力が実現します。他のCLIP法と同様に、eCLIPは生細胞のUVクロスリンクを使用して共有結合したRBP-RNA相互作用に依存しています。次に細胞を溶解し、限定的RNase処理を用いてRNAを断片化する。次に、標的RBPを特異的に認識する抗体を用いて、特定のRBP（およびそれに結合したRNA）を免疫沈降させる。3' RNAアダプターをライゲーションした後、免疫沈降した物質（およびペアとなる入力サンプル）を変性タンパク質ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写する。膜からタンパク質サイズから75 kDa上の領域を切り出し、プロテイナーゼKで処理してRNAを遊離させる。精製後、RNAを逆転写して一本鎖DNAにし、2番目のアダプターをライゲーションする。2番目のアダプターをcDNAにライゲーションすることで、eCLIPはiCLIPと同様に切断されたcDNAを識別し、高解像度でRNA-タンパク質相互作用部位を研究することができる。次にPCR増幅を用いて、ハイスループットシーケンスに十分な量の材料を得る。eCLIPは、miRNA標的の同定やm6AなどのRNA修飾のプロファイリングにも使用できる。eCLIPデータセットは、検証済みの市販抗体を用いて150種類以上のRBPについて作成されている。^{[ 37 ]}

sCLIP (simple CLIP) は、入力 RNA の量が少なく、免疫沈降 RNA の放射性標識を省略できる技術です。この方法は、免疫沈降 RNA の線形増幅に基づいており、入力材料の量を大幅に削減し、いくつかの精製ステップを省略しているにもかかわらず、シーケンス ライブラリの複雑性を向上させます。さらに、高感度のビオチンベースの標識技術を使用することで、免疫沈降 RNA の放射性標識なしの可視化が可能になります。この方法は、バイオ インフォマティクス プラットフォームとともに、開始材料の量が限られていることが多い生物医学分野 (貴重な臨床サンプルの場合など) における RNA-タンパク質相互作用ネットワークに関する深い洞察を提供するように設計されています。^{[ 38 ]}また、個々のヌクレオチドの解像度は維持しつつ、元の iCLIP 方法とは 1 つ以上のステップが異なる iCLIP のバリアントも開発されています。これには、iCLIP2、irCLIP、iiCLIP、iCLIP1.5 などがあります。

CLIPの改良版として、変異酵素または修飾特異的抗体を用いて、miCLIPまたはm6A-CLIPと呼ばれる方法でメチル化RNA部位が同定された。^{[ 31 ] [ 32 ] [ 39 ] [ 2 ]}

RNA結合タンパク質は多タンパク質複合体の構成要素であることが多く、様々な遺伝子由来のRNAは細胞内に様々な量で存在するため、特定のタンパク質を免疫沈降する際に、共精製されたタンパク質に結合したRNAやビーズに非特異的に付着したRNAが分離されることはよくある。RIPなどの初期の免疫沈降法で得られたデータの特異性は、タンパク質濃度やイオン条件などの実験の反応条件に依存することが実証されており、細胞溶解後のRNA結合タンパク質の再会合により、人工的な相互作用が検出される可能性がある。^{[ 40 ]} RNA-タンパク質相互作用を維持するためにホルムアルデヒド架橋法が使用されてきたが、これらはタンパク質-タンパク質架橋も生成する。CLIPは、タンパク質-RNAの直接接触に特異的なUV架橋を用いることで、タンパク質-タンパク質架橋を回避し、高い特異性を確保するとともに、タンパク質-RNA相互作用部位の位置情報も取得する。

UV架橋は共有結合を形成するため、架橋されたRNA断片はプロテイナーゼK消化後も短いペプチドを保持し、これを利用して架橋部位を特定することができる。逆転写は多くの場合、架橋部位で切断され、iCLIPで利用される切断型cDNAが生成される一方、リードスルーcDNAは架橋部位に突然変異を含むことが多い（HITS-CLIPおよびPAR-CLIPを参照）。^{[ 2 ]}

すべてのCLIPライブラリー生成プロトコルは、中程度の量の細胞または組織（50～100  mg）を必要とし、多数の酵素ステップとカスタマイズされた計算解析を必要とします。^{[ 12 ] [ 41 ]}特定のステップは最適化が難しく、効率が低いことがよくあります。たとえば、RNaseによる過剰消化は、同定された結合部位の数を減少させる可能性があるため、最適化する必要があります。^{[ 27 ]}架橋効率もタンパク質間で異なり、^{[ 42 ]}架橋のヌクレオチドバイアスが報告されています。^{[ 43 ]}たとえば、生細胞でin vivoでタンパク質-RNA複合体を研究したときとin vitroで研究したときの架橋部位と濃縮されたモチーフを比較することによって、^{[ 44 ]}ただし、濃縮されたモチーフの発見のためにそのようなバイアスを最小限に抑える方法が開発されています。^{[ 45 ]} TargetScanから得られた計算によって予測されたmiRNAターゲットは、miRNAターゲットの同定においてCLIPに匹敵し、既存の予測に対するその有用性について疑問が生じます。^{[ 46 ]} CLIP法は免疫沈降に依存するため、架橋RNAは場合によっては抗体-エピトープ相互作用に影響を与える可能性がある。最終的に、大きな違いが観察された。したがって、生のCLIP結果では、細胞内のRNA-タンパク質結合部位の相互作用を徹底的に調査するために、さらなる計算解析が必要となる。