転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、特定のDNA配列を切断するように設計できる制限酵素です。TALエフェクター DNA結合ドメインをDNA切断ドメイン（ DNA鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作られます。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、実質的に任意のDNA配列に結合するように設計できるため、ヌクレアーゼと組み合わせると、DNAを特定の位置で切断できます。^[1]制限酵素は細胞に導入して遺伝子編集に使用したり、インサイチューゲノム編集（改変ヌクレアーゼによるゲノム編集と呼ばれる技術）に使用したりできます。ジンクフィンガーヌクレアーゼやCRISPR/Cas9と並んで、TALENはゲノム編集の分野で著名なツールです。

TALエフェクターは、キサントモナス細菌が植物に感染したときに、そのタイプIII分泌システムを介して分泌されるタンパク質です。^[2] DNA結合ドメインには、12番目と13番目のアミノ酸が異なる、高度に保存された33〜34アミノ酸の繰り返し配列が含まれています。繰り返し可変二残基（RVD）と呼ばれるこれらの2つの位置は、非常に可変性があり、特定のヌクレオチド認識と強い相関関係を示しています。^{[3] [4]} アミノ酸配列とDNA認識のこの直接的な関係により、適切なRVDを含む繰り返しセグメントの組み合わせを選択することで、特定のDNA結合ドメインを設計できるようになりました。^[1]特に、RVDのわずかな変更と「非従来型」RVD配列の組み込みにより、標的の特異性が向上します。^[5]

FokIエンドヌクレアーゼの末端からの非特異的DNA切断ドメインは、酵母アッセイで活性なハイブリッドヌクレアーゼの構築に使用できます。 ^{[6] [7]} これらの試薬は、植物細胞^{[8] [9]および動物細胞[9] [10] [11] [12]} でも活性です。初期のTALEN研究では野生型のFokI切断ドメインを使用しましたが、その後のTALEN研究^{[11] [13] [14]では、切断特異性[15] [16]}および切断活性[ ¹⁷ ]を改善するように設計された変異を持つFokI切断ドメインバリアントも使用されました。FokIドメインは二量体として機能し、適切な方向と間隔で標的ゲノム内の部位に固有のDNA結合ドメインを持つ2つのコンストラクトが必要です。 TALE DNA結合ドメインとFokI切断ドメイン間のアミノ酸残基数と、2つの個々のTALEN結合部位間の塩基数は、高い活性を達成するための重要なパラメータであると思われる。^{[10] [18]}

TALE結合ドメインのアミノ酸配列とDNA認識との間の単純な関係により、タンパク質を効率的に設計することができます。この場合、TALE結合ドメインに見られる反復配列の不適切なアニーリングのために、人工遺伝子合成に問題があります。 ^[19]これに対する1つの解決策は、公開されているソフトウェアプログラム（DNAWorks ^[20]）を使用して、2段階PCRオリゴヌクレオチドアセンブリとそれに続く全遺伝子増幅でのアセンブリに適したオリゴヌクレオチドを計算することです。設計されたTALEコンストラクトを生成するための多くのモジュールアセンブリスキームも報告されています。^{[9] [19] [21] [22] [23] [24]どちらの方法も、}ジンクフィンガーDNA認識ドメインを生成するためのモジュールアセンブリ法と概念的に類似した、DNA結合ドメインを設計するための体系的なアプローチを提供します。

TALEN コンストラクトが組み立てられると、プラスミドに挿入されます。次に、ターゲット細胞にプラスミドを導入すると、遺伝子産物が発現して核に入り、ゲノムにアクセスします。あるいは、TALEN コンストラクトを mRNA として細胞に送達することもできます。これにより、TALEN 発現タンパク質のゲノム統合の可能性が排除されます。mRNA ベクターを使用すると、相同組換え修復 (HDR) のレベルと遺伝子編集中の導入の成功率も大幅に向上します。

TALEN は、細胞が修復メカニズムで反応する二本鎖切断 (DSB) を誘発することでゲノムを編集するために使用できます。

非相同末端結合（NHEJ）は、アニーリングのための配列の重複がほとんどないか全くない場合に、二本鎖切断の両側からDNAを直接連結する。この修復機構は、インデル（挿入または欠失）または染色体再配置を介してゲノムにエラーを誘発し、そのようなエラーにより、その場所でコード化された遺伝子産物が機能しなくなる可能性がある。^[10] この活性は、使用する種、細胞タイプ、標的遺伝子、およびヌクレアーゼによって異なる可能性があるため、新しいシステムを設計する際には監視する必要がある。PCRで増幅された2つの対立遺伝子間の違いを検出する、単純なヘテロ二本鎖切断アッセイを実行できる。切断産物は、単純なアガロースゲルまたはスラブゲルシステムで視覚化できる。

あるいは、外因性の二本鎖DNA断片の存在下でNHEJを介してDNAをゲノムに導入することもできる。^[10]

相同組換え修復では、導入された二本鎖配列が修復酵素のテンプレートとして使用されるので、DSBに外来DNAを導入することもある。^[10]

TALENは植物ゲノムを効率的に改変するために使用されており、^[25]好ましい栄養価を持つ経済的に重要な食用作物を生み出しています。^{[26]また、}バイオ燃料 の生産ツールの開発にも利用されています。^[27] さらに、安定的に改変されたヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞（IPSC）クローンとヒト赤血球細胞株を設計するために使用され、^{[11] [28]}ノックアウトC.エレガンス、^[12] ノックアウトラット、^[13]ノックアウトマウス、^[29]ノックアウトゼブラフィッシュの生成にも使用されています。^{[14] [30]}さらに、この方法はノックイン生物の生成にも使用できます。Wuらは、結核に対する抵抗力の向上を誘導するためにTalenニッカーゼを使用してSp110ノックイン牛を取得しました。^[31]このアプローチは、1細胞胚へのTALEN mRNAマイクロインジェクションによるノックインラットの生成にも使用されている。^[32]

TALENは、疾患の根底にある遺伝子エラーを修正するために実験的に利用されてきた。^{[33]例えば、}鎌状赤血球症、^{[28] [34]}色素性乾皮症、^[35]表皮水疱症[36]などの疾患を引き起こす遺伝子欠陥を修正するためにin vitroで使用されている。最近、TALENは免疫システムを利用して癌と戦うためのツールとして使用できることが示され、TALENを介した標的化により、化学療法薬に耐性があり抗腫瘍活性を示すT細胞を生成できる。^{[37] [38]}

理論的には、人工TALEN融合体のゲノムワイドな特異性により、正しい外因性テンプレートからの相同性誘導修復を介して個々の遺伝子座のエラーを修正することが可能になる。^[33] しかし、現実には、 TALENのin situ適用は、効率的な送達メカニズムの欠如、未知の免疫原性因子、およびTALEN結合の特異性の不確実性によって現在制限されている。^[33]

TALENのもう一つの新たな用途は、メガヌクレアーゼなどの他のゲノム工学ツールと組み合わせる能力である。TALエフェクターのDNA結合領域をメガヌクレアーゼの切断ドメインと組み合わせることで、TALエフェクターの工学的容易さと非常に特異的なDNA結合活性とメガヌクレアーゼの低い部位頻度と特異性を組み合わせたハイブリッドアーキテクチャを作成することができる。^[39]

他のゲノム編集技術と比較すると、TALENは難易度とコストの点で中間に位置します。ZFNとは異なり、 TALENは単一のヌクレオチドを認識します。ZFNとその標的ヌクレオチドトリプレットとの相互作用を作成するよりも、TALEN DNA結合ドメインとその標的ヌクレオチドとの相互作用を操作する方がはるかに簡単です。^[40]一方、CRISPRはタンパク質/ DNA認識ではなく、リボヌクレオチド複合体の形成に依存しています。gRNA ^{[定義が必要]は、標的配列にPAMサイト[定義が必要]}がないため、実現可能性に関して制限がある場合があり、安価に製造できるにもかかわらず、現在の開発によりTALENのコストが大幅に削減され、CRISPRベースのゲノム編集^{[説明が必要]}と同様の価格と時間の範囲になっています。

活性ヌクレアーゼのオフターゲット活性は、望ましくない二本鎖切断を引き起こし、その結果、染色体再編成や細胞死を引き起こす可能性があります。利用可能な技術の相対的なヌクレアーゼ関連毒性を比較する研究が行われてきました。これらの研究^[18]とDNA結合とヌクレアーゼ活性の間の最大理論距離に基づいて、TALENコンストラクトは現在利用可能な技術の中で最も精度が高いと考えられています。^[41]

• 人工ヌクレアーゼによるゲノム編集
• ジンクフィンガーヌクレアーゼ
• メガヌクレアーゼ
• クリスパー

• E-TALEN.org TALEN設計のための総合ツール
• 今月のPDB分子 タンパク質データベースの月間構造ハイライトのエントリ