Loading article…
無細胞タンパク質アレイ技術は、DNAテンプレートから標的タンパク質をin vitroで合成することにより、タンパク質マイクロアレイを作製します。このタンパク質マイクロアレイの合成方法は、従来のタンパク質アレイ製造方法が抱えていた多くの障害や課題を克服し、プロテオミクスにおけるタンパク質マイクロアレイの普及を妨げていた問題を解消します[ 1 ] 。この技術で作製されたタンパク質アレイは、タンパク質間相互作用だけでなく、DNAや脂質などの他の細胞分子とのタンパク質相互作用の試験にも使用できます。その他の用途としては、酵素阻害アッセイや抗体特異性のスクリーニングなどがあります。
DNAマイクロアレイの爆発的な成功は、タンパク質マイクロアレイへの大きな期待を生み出した。しかし、DNAマイクロアレイで培われた必要なツールやノウハウが既に整い、応用可能な状態にあるにもかかわらず、タンパク質マイクロアレイは期待通りには普及していない。その大きな理由の一つは、タンパク質マイクロアレイの作製はDNAマイクロアレイに比べてはるかに手間がかかり、技術的にも困難であることである。
従来のタンパク質アレイ製造法では、数百または数千のタンパク質を個別に生体内で発現させ、その後、タンパク質を個別に精製し、固体表面に固定化する必要がある。無細胞タンパク質アレイ技術は、細菌細胞でのタンパク質発現とそれに続く精製の必要性を回避することで、タンパク質マイクロアレイの構築を簡素化しようとするものである。この技術は、 DNAテンプレート、転写および翻訳の原材料と機構を含む細胞抽出物が提供されれば、完全な細胞がなくてもタンパク質合成が可能であることを示す、利用可能な無細胞タンパク質合成技術を活用している。 [ 2 ]無細胞タンパク質アレイ技術で使用される一般的な細胞抽出物の供給源には、小麦胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球などがある。超好熱菌、ハイブリドーマ、アフリカツメガエル卵母細胞、昆虫、哺乳類、ヒト細胞などの他の供給源からの細胞抽出物も使用されている。[ 3 ]
標的タンパク質は、 DNAテンプレートから直接、タンパク質マイクロアレイ上でその場で合成されるため、従来のタンパク質マイクロアレイ製造における多くの工程とそれに伴う技術的な制約を回避できます。さらに重要なのは、タンパク質の発現を並行して行うことができる点です。つまり、すべてのタンパク質を単一の反応で同時に発現させることが可能です。このように複数のタンパク質を同時に発現できる能力は、製造工程における大幅な時間短縮につながります。
in situ法では、タンパク質捕捉試薬または抗体で予めコーティングされたタンパク質アレイ表面上でタンパク質合成が行われます。新たに合成されたタンパク質がリボソームから放出されると、各新生タンパク質のN末端またはC末端に合成されたタグ配列が捕捉試薬または抗体に結合し、タンパク質が固定化されてアレイが形成されます。一般的に使用されるタグには、ポリヒスチジン（His）6およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）などがあります。
様々な研究グループがそれぞれ独自の手法を開発しており、アプローチはそれぞれ異なるものの、大きく3つのグループに分類できる。
NAPPA [ 4 ]は、既に同じタンパク質捕捉表面に固定化されている DNA テンプレートを使用します。DNA テンプレートはビオチン化され、タンパク質捕捉表面に予めコーティングされたアビジンに結合します。GST でタグ付けされた新しく合成されたタンパク質は、捕捉表面に予めコーティングされている隣接するポリクローナル抗 GST 捕捉抗体に結合することによって、テンプレート DNA の隣に固定化されます。この方法の主な欠点は、プロセスの開始時に余分な面倒な準備手順があることです。(1)発現準備ベクターへのcDNAのクローニング、(2) 転写を妨げないようにプラスミドDNAをビオチン化する必要があること。さらに、タンパク質が DNA テンプレートおよび捕捉抗体と共局在するため、結果として得られるタンパク質アレイは「純粋」ではありません。[ 3 ]
NAPPAとは異なり、PISA [ 5 ]は、DNAテンプレートを反応混合物に遊離分子として添加するため、DNA固定化を完全に回避します。2006年、別のグループは、最大13,000スポットの高密度タンパク質マイクロアレイ上にDNAテンプレートと無細胞転写および翻訳混合物をスポットするために多重スポット技術を使用することで、この方法を改良し小型化しました。[ 6 ]これは、サブナノリットルの小さな液滴内で起こる転写/翻訳反応の試薬を正確かつ順次供給するために使用される自動システムによって可能になりました。
この方法は、 mRNAディスプレイ技術の応用です。まずPCR DNAをmRNAに転写し、両端にビオチンとピューロマイシンで修飾した一本鎖DNAオリゴヌクレオチドをmRNAの3'末端にハイブリダイズさせます。次に、mRNAをスライド上にアレイ化し、スライド上に予めコーティングされたストレプトアビジンへのビオチンの結合によって固定化します。その後、細胞抽出液をスライド上に滴下し、その場で翻訳を行います。リボソームがハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに到達すると、停止してピューロマイシン分子を新生ポリペプチド鎖に組み込み、DNAオリゴヌクレオチドを介して新しく合成されたタンパク質をマイクロアレイに結合させます。[ 7 ] mRNAをRNaseで消化すると、純粋なタンパク質アレイが得られます。この方法で生成されるタンパク質スポットは非常に鮮明で、高密度で生成できます。
ナノウェルアレイ形式は、少量の反応容器またはナノウェルで個々のタンパク質を発現するために使用されます[ 8 ] [ 9 ]（図4）。この形式は、タンパク質活性の潜在的な損失につながる可能性のある標的タンパク質の固定化を回避できるため、好まれる場合があります。アレイの小型化は、スクリーニングアッセイで使用される可能性のある溶液と貴重な化合物も節約します。さらに、個々のウェルの構造特性は、チャンバー間の相互汚染を防ぐのに役立ちます。2012年に、拡散を防ぐためにナノウェルアレイを使用した改良型NAPPAが発表されました。ここでは、DNAは抗GST抗体とともにウェルに固定化されました。次に、無細胞発現ミックスが加えられ、ウェルは蓋で閉じられました。GSTタグを含む新生タンパク質はウェル表面に結合し、より高密度で相互汚染がほとんどないNAPPAアレイを可能にしました。[ 10 ]
DNAアレイからタンパク質アレイへの変換（DAPA）は、単一のDNAテンプレートアレイからオンデマンドでタンパク質アレイを「印刷」することにより、繰り返しタンパク質アレイを作製するために2007年に開発された方法です[ 11 ]（図5）。まず、DNAテンプレートのアレイをガラススライド上にスポットして固定化します。次に、スライドをタンパク質捕捉試薬でプレコートした2枚目のスライドと向かい合わせに組み立て、転写と翻訳を行うために細胞抽出液に浸した膜を2枚のスライドの間に置きます。新しく合成されたHisタグ付きタンパク質をスライド上に固定化してアレイを形成します。この論文では、20回の複製のうち18回でタンパク質マイクロアレイのコピーを作成することができました。DNAがDNase、分解、または機械的摩耗によって損傷を受けない限り、このプロセスは必要に応じて何度でも繰り返すことができます。
無細胞タンパク質アレイ技術の多くの利点は、従来のタンパク質マイクロアレイ製造方法で使用される細胞ベースの発現システムの限界を克服するものである。
この方法は（NAPPAを除き）DNAクローニングを回避し、PCR DNAを用いることで遺伝情報を迅速に機能性タンパク質に変換できる。製造工程の削減とシステムの小型化により、試薬消費量の削減と製造コストの低減が実現する。
抗体を含む多くのタンパク質は、不溶性、ジスルフィド結合、宿主細胞毒性などの問題により、宿主細胞内で発現させることが困難です。[ 1 ]無細胞タンパク質アレイにより、このようなタンパク質の多くがタンパク質マイクロアレイで使用できるようになります。
非常に安定した分子であるDNAとは異なり、タンパク質は安定性や物理化学的性質が異なる多様な分子群です。タンパク質マイクロアレイにおいて、タンパク質の折り畳み構造と機能を固定化状態で長期間維持することは大きな課題です。無細胞法を用いることで、タンパク質マイクロアレイを迅速にオンデマンドで作製できるため、長期保存に伴うあらゆる問題を解消できます。
この方法は、PCR産物、プラスミド、mRNAなど、さまざまなテンプレートに適用可能です。合成中に、タンパク質の折り畳み、ジスルフィド結合の形成、修飾、またはタンパク質活性のための環境を調整するために、追加のコンポーネントを含めることができます。[ 3 ]
タンパク質相互作用:タンパク質間相互作用[ 4 ]および代謝物、脂質、DNA、小分子などの他の分子とのタンパク質相互作用をスクリーニングするため。[ 14 ]酵素阻害アッセイ: [ 8 ]ハイスループットの薬剤候補スクリーニングおよびバイオテクノロジーで使用する新規酵素の発見のため。抗体特異性のスクリーニング。[ 15 ]
[ 16 ]