逆相タンパク質ライセートマイクロアレイ

逆相タンパク質ライセートマイクロアレイ（RPMA）は、ドットブロットプラットフォームとして設計されたタンパク質マイクロアレイであり、高品質の抗体が利用できる場合に、多数の生物学的サンプル中のタンパク質発現レベルを同時に定量的に測定することを可能にする。^[1]

技術的には、(a) 細胞溶解物（無傷細胞またはレーザー捕捉顕微解剖細胞から採取）や、(b) 血清、脳脊髄液、尿、硝子体、唾液などの体液のごく微量をマイクロアレイ上の個々のスポットに固定し、単一の特異的抗体とともにインキュベートして、多数のサンプルにわたる標的タンパク質の発現を検出します。^[2] RPPAの概要ビデオが利用可能です。^{[3] 1つのマイクロアレイは、設計に応じて、一連の複製で印刷された数百から数千のサンプルを収容できます。検出は、}化学発光、蛍光、または比色アッセイによって、一次標識抗体または二次標識抗体を使用して行われます。次にアレイを画像化し、得られたデータを定量化します。

マルチプレックス化は、同じ溶解液でスポットされた複数のアレイを異なる抗体で同時にプローブすることによって達成され、定量的較正アッセイとして実装できます。^[4]さらに、RPMA は全細胞または未解剖またはマイクロ解剖された細胞溶解液を利用できるため、他の高スループット技術ではアクセスできない翻訳後修飾タンパク質に関する直接定量可能な情報を提供できます。^{[5] [6]}このように、RPMA は高次元のプロテオームデータを高スループット、高感度、定量的に提供します。^[5]ただし、RPMA によって生成されるシグナルは、ELISA や免疫組織化学などの他の技術で見られるように、非特異的な一次抗体または二次抗体の結合から生成される可能性があるため、単一スポットからのシグナルは交差反応性による可能性があります。 したがって、RPMA で使用される抗体は、ウェスタンブロットによって細胞溶解液に対する特異性と性能について慎重に検証する必要があります。^{[1] [7]}

RPMA には、バイオマーカープロファイリング、細胞シグナル伝達解析、臨床予後、診断、治療予測のためのがん細胞、体液、組織におけるタンパク質発現の定量分析など、さまざまな用途があります。 ^[1]これは、1 人または多数の患者のさまざまな臓器からさまざまな細胞株の溶解物やさまざまな病期のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション組織生検を使用して RPMA を構築し、1 回の実験でタンパク質マーカーレベルの相対的または絶対的存在量または差次的発現を決定できるため可能です。また、複数の時点でのさまざまな刺激や薬物投与量に対するタンパク質の動態をモニタリングするためにも使用されます。^[1] RPMA が使用されるその他のアプリケーションには、タンパク質シグナル伝達経路の探索とマッピング、分子薬物標的の評価、候補薬物の作用機序の理解などがあります。^[8]また、がん患者の治療上の意思決定を促進またはガイドするための潜在的な早期スクリーニング検査としても提案されています。

その他のタンパク質マイクロアレイには、フォワードタンパク質マイクロアレイ (PMA) と抗体マイクロアレイ(AMA) があります。PMA は、抗体やその他の小さな化合物によってスクリーニングされる、個々の精製された、場合によっては変性された組み換えタンパク質をマイクロアレイ上に固定します。AMA は、マイクロアレイに塗布されたサンプルから分析対象物を捕捉する抗体を固定します。^{[4] [6]}ターゲットタンパク質は、直接標識するか、分析対象タンパク質上の異なるエピトープに対する二次標識抗体によって検出されます (サンドイッチアプローチ)。PMA と AMA はどちらも、分析対象物を捕捉するためのベイトの固定化を伴うため、フォワードフェーズアレイに分類できます。フォワードフェーズアレイでは、各アレイは、細胞溶解物や患者の血清などの 1 つのテストサンプルでインキュベートされますが、サンプル内の複数の分析対象物が同時にテストされます。^[4]図 1 は、分子レベルでのフォワード (ここでは抗体をベイトとして使用) および逆フェーズタンパク質マイクロアレイを示しています。

研究の課題や研究の種類と目的に応じて、アレイの内容、サンプル数、マイクロプレート内のサンプルの配置、アレイのレイアウト、マイクロアレイヤーの種類、適切な検出抗体、信号検出方法、コントロールの組み込み、サンプルの品質管理を選択して RPMA を設計できます。その後、実際の実験が研究室でセットアップされ、得られた結果が定量化され、分析されます。実験段階は次のとおりです。

細胞は、適切な培地中で37 度、5% CO2 で T-25 フラスコ内で培養されます_。^[1]研究の設計に応じて、細胞が合流した後、薬剤や成長因子で処理したり、溶解ステップの前に放射線を照射したりすることができます。時間経過研究では、刺激剤をフラスコのセットに同時に追加し、フラスコを異なる時点で処理します。^[1]薬剤投与量研究では、フラスコのセットを異なる用量の薬剤で処理し、すべてのフラスコを同時に収集します。^[1]

組織の細胞分画溶解物を含むRPMAを作成する場合は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）または細針吸引法を使用して、組織領域から特定の細胞を顕微鏡的に分離します。^{[4] [8]}

上記のいずれかの方法で採取した細胞ペレットは、細胞溶解緩衝液で溶解され、高タンパク質濃度が得られる。^[1]

溶解液のアリコートをプールし、2次元シングルレーンSDS-PAGEで分離し、続いてニトロセルロース膜上でウェスタンブロッティングを行う。膜は4ミリメートルのストリップに切断され、各ストリップは異なる抗体でプローブされる。単一バンドのストリップは、RPMAの使用に適した特定の抗体であることを示す。抗体の性能は、RPMAの実際のサンプル収集の前に、同じ条件下でより小さなサンプルサイズで検証する必要がある。^{[1] [7]}

細胞溶解液を収集し、比色法を使用する場合は6～10倍に段階希釈し、蛍光検出を使用する場合は希釈しません（比色検出よりも蛍光のダイナミックレンジが大きいため）。段階希釈液は、384ウェルまたは1536ウェルのマイクロタイタープレートに複製して塗布されます。^[1]次に、溶解液をAushon BioSystem 2470やFlexysロボット（Genomic solution）などのマイクロアレイヤーで、ニトロセルロースまたはPVDF膜でコーティングしたスライドガラスに印刷します。^{[1] [9]}ソリッドピンシステムを備えたAushon 2470は、非常に粘性の高い溶解液でアレイを作製するのに使用でき、湿度環境制御と自動スライド供給システムを備えているため、理想的な選択肢です。^[1]そうは言っても、Arrayitマイクロアレイ印刷ピンも使用でき、より少ない溶解液ではるかに高いスループットでマイクロアレイを作製できることを示す論文が発表されています。^{[10]膜コーティングされたガラススライドは、Schleicher and Schuell Bioscience（現在はGE Whatmanが所有www.whatman.com）、 [9]} Grace BioLabs（www.gracebio.com）、Thermo Scientific、SCHOTT Nexterion（www.schott.com/nexterion）など、いくつかの異なる企業から市販されています。^[11]

スライドが印刷された後、アレイ上の非特異的結合部位は I-Block などのブロッキング バッファーを使用してブロックされ、アレイは一次抗体、続いて二次抗体でプローブされます。検出は通常、DakoCytomation 触媒シグナル増幅 (CSA) システムで行われます。シグナル増幅のために、スライドはストレプトアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体でインキュベートされ、続いてビオチン-チラミド/過酸化水素、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼでインキュベートされます。過酸化水素を使用して現像を完了し、スライドのスキャンを取得します (1)。チラミド シグナル増幅は次のように機能します。固定化されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(HRP) は、過酸化水素の存在下でチラミドを反応中間体に変換します。活性化されたチラミドは、活性化 HRP 酵素が結合している部位に近い隣接タンパク質に結合します。これにより、その部位にチラミド分子がさらに沈着し、シグナル増幅が起こります。^{[12] [13]}

ランス・リオッタとエマニュエル・ペトリコインは2001年にRPMA技術を発明し（以下の歴史のセクションを参照）、近赤外蛍光技術を使用した多重検出法を開発しました。^[14]この研究では、アレイごとに観察されるエンドポイントの数を効果的に2倍にすることができるデュアル染料ベースのアプローチの使用が報告されており、たとえば、リン酸化特異的レベルと総タンパク質レベルの両方を一度に測定および分析できます。

免疫染色を行ったら、タンパク質発現を定量化する必要があります。比色検出技術を使用する場合は、通常の光学フラットベッドスキャナの反射モードを使用して信号レベルを取得できます^[1]。蛍光技術を使用する場合は、TECAN LSシステムなどのレーザースキャンによって信号レベルを取得できます。オンラインで利用できる2つのプログラム（P-SCANとProteinScan）を使用して、スキャンした画像を数値に変換できます^[1] 。これらのプログラムは、各スポットでの信号強度を定量化し、線量補間アルゴリズム（DI ₂₅）を使用して、各サンプルの単一の正規化されたタンパク質発現レベル値を計算します。正規化は、各サンプル間の総タンパク質濃度の差を考慮し、抗体染色をサンプル間で直接比較できるようにするために必要です^{[15]。これは、総タンパク質を}コロイド金総タンパク質染色またはSypro Ruby総タンパク質染色で染色する実験を並行して実行することで実現できます。 ^[1]複数のRPMAを分析すると、シグナル強度の値をヒートマップとして表示することができ、ベイジアンクラスタリング分析やシグナル伝達経路のプロファイリングが可能になります。^[15] RPMA用にカスタム設計された最適なソフトウェアツールは、Vigene Tech, Inc.のMicrovigeneです。

RPMAの最大の強みは、従来のウエスタンブロッティングやELISAでは不可能な、極めて少量の入力材料からのタンパク質の高スループット、マルチプレックス、超高感度検出を可能にすることです。^{[1] [9]}マイクロアレイ上のスポットサイズは直径85〜200マイクロメートルと小さいため、1回の実験で同じ抗体を使用して何千ものサンプルを分析できます。^[9] RPMAは感度が向上し、ピコグラム範囲のタンパク質を検出できます。^[9]アトグラム範囲のタンパク質の検出も報告されている研究者もいます。^[9]これは、マイクログラム量のタンパク質を必要とするELISAによるタンパク質検出に比べて大幅に改善されています（6）。 RPMAの感度の向上はアレイの小型フォーマットによるもので、これにより信号密度（信号強度/面積）が増加します^[9]。 RPMA の高感度により、生検サンプルなどのごく少量の出発材料から、リン酸化シグナル伝達タンパク質などの低存在量のタンパク質やバイオマーカーを検出することができます。生検サンプルには、正常組織が混入していることがよくあります。^[4]レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用すると、わずか 10 個の細胞から溶解物を分析することができ、^[4]各スポットには細胞 1 個当たりの 100 分の 1 未満のタンパク質しか含まれていません。

RPMAが従来の順方向相タンパク質アレイに比べて大きく改善されている点は、タンパク質の検出に必要な抗体の数が少なくなっていることです。順方向相タンパク質アレイでは通常、サンドイッチ法を使用して目的のタンパク質を捕捉して検出します。 ^{[4] [15]これは、タンパク質上に2つの}エピトープ（タンパク質を捕捉するためのものとタンパク質を検出するためのもの）があり、それらに対して特異的な抗体が利用可能であることを意味します。 ^[15]他の順方向相タンパク質マイクロアレイはサンプルを直接ラベル付けしますが、異なるタンパク質に対するラベル付け効率にはしばしばばらつきがあり、ラベル付けによって抗体が結合するエピトープが破壊されることも少なくありません。^[15]サンプルを直接ラベル付けする必要がないため、RPMAではこの問題は克服されています。

RPMA がフォワード相タンパク質マイクロアレイやウェスタンブロッティングよりも優れているもう 1 つの強みは、チップ上のすべてのサンプルが同じ一次抗体と二次抗体、および同じ濃度の増幅試薬で同じ時間プローブされるため、結果が均一になることです。^[9]これにより、すべてのサンプルのタンパク質レベルの違いを定量化できます。さらに、各サンプルをチップ上に連続希釈 (比色定量) で印刷することで、分析がアッセイの線形ダイナミック レンジ内でのみ実行されるようにする内部コントロールが提供されます。^[4]最適な方法は、キャリブレーターと高および低コントロールを同じチップ上に直接印刷することで、時間の経過や実験間で各タンパク質を定量的に測定する比類のない能力が得られることです。組織マイクロアレイで発生する問題は、抗原の回復と免疫組織化学の固有の主観性です。抗体、特にリン酸化特異的試薬は、タンパク質の 3 次元構造によりマスクされる可能性のある線形ペプチド配列を検出することがよくあります。^[15] RPMAではサンプルを変性させて隠れたエピトープを明らかにできるため、この問題は克服されます。^[15]

RPMA の最大の制限は、すべての免疫測定法に言えることですが、タンパク質の検出に抗体が必要なことです。現在、分析可能なシグナルを発する抗体が存在するシグナル伝達タンパク質の数は限られていますが、その数は急速に増加しています。^[15]さらに、適切な抗体を見つけるには、RPMA 分析を開始する前に、ウエスタンブロット法で多くの抗体を徹底的にスクリーニングする必要があります。^[1]この問題を克服するために、予想される範囲内で優れた結合特異性を持つ抗体のウエスタンブロット結果を表示する 2 つのオープン リソース データベースが作成されました。^{[1] [16] [17]}さらに、RPMA はウエスタンブロット法とは異なり、タンパク質画分を分子量で分離しません。^[1]したがって、事前に抗体の検証を行うことが重要です。

RPMAは、この技術を発明したランス・リオッタとエマニュエル・ペトリコインの論文で2001年に初めて紹介されました。^[8]著者らはこの技術を使用して、組織学的に正常な前立腺上皮、前立腺上皮内腫瘍、および患者に適合した浸潤性前立腺癌のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、顕微鏡的移行段階での生存促進チェックポイントタンパク質の状態を分析することに成功しました。^[8]それ以来、RPMAは多くの基礎生物学、トランスレーショナルリサーチ、および臨床研究で使用されてきました。さらに、この技術は現在、転移性大腸癌および乳癌の患者がRPMAの結果に基づいて治療のために選択される臨床試験に初めて導入されています。この技術は、Theranostics Health, Inc. によって個別化医療ベースのアプリケーション向けに商品化されています。

• http://www.bio-itworld.com/BioIT_Article.aspx?id=97660
• http://discover.nci.nih.gov/abminer