抗体マイクロアレイ

抗体マイクロアレイ（抗体アレイとも呼ばれる）は、タンパク質マイクロアレイの特定の形式です。この技術では、捕捉された抗体の集合体がガラス、プラスチック、膜、シリコンチップなどの固体表面にスポットされ固定され、抗体と標的抗原との相互作用が検出されます。抗体マイクロアレイは、血清、血漿、細胞または組織溶解物を含むさまざまな生体液からのタンパク質発現を検出するためによく使用されます。抗体アレイは、基礎研究と医療および診断アプリケーションの両方に使用できます。^{[1] [2] [3] [4]}

抗体マイクロアレイの概念と方法論は、 1983年にツェ・ウェン・チャンがペンシルバニア州マルバーンのセントコアで働いていたときに、科学出版物^[5]と一連の特許^{[6] [7] [8]}で初めて導入されました。チャンは「抗体マトリックス」という用語を作り出し、小さなガラスやプラスチックの表面上の微小な抗体スポットの「アレイ」配置について論じました。彼は、10×10（合計100個）と20×20（合計400個）の抗体スポットのグリッドを1×1cmの表面に配置できることを実証しました。彼はまた、ほとんどの抗体に最適な10μg/mLの濃度で抗体をコーティングした場合、1mgの抗体で直径0.25mmのドットを2,000,000個作ることができると推定しました。チャンの発明は、CD抗原やHLAアロタイプ抗原、ウイルスや細菌などの粒子抗原、可溶性抗原などの特定の表面抗原を持つ細胞の検出と定量化に抗体マイクロアレイを使用することに焦点を当てていました。論文や特許に記載されている「1回のサンプル塗布で複数の測定」の原理、アッセイ構成、吸収ドットを配置するメカニズムは、さまざまな種類のマイクロアレイに一般的に適用できるはずです。ツェ・ウェン・チャンとナンシー・T・チャンは、1986年にテキサス州ヒューストンでTanox社を設立したとき、新しいスタートアップを構築するための技術基盤の一部として、セントコアから抗体マトリックス特許の権利を購入しました。彼らが開発した最初の製品は、「免疫吸着サイトメトリー」と呼ばれるアッセイで、^[9] HIV感染者の血液中の免疫状態、つまりCD3 ⁺、CD4 ⁺、CD8 ⁺ T細胞の濃度と比率をモニターするために使用できました。

タンパク質マイクロアレイに基づくリガンド結合アッセイの理論的背景は、1980年代後半にロジャー・エキンスとその同僚によってさらに発展しました。^{[10] [11] [12]このモデルによれば、抗体マイクロアレイは分析対象パネルの同時スクリーニングを可能にするだけでなく、従来のスクリーニング方法よりも感度が高く迅速になります。大規模なタンパク質セットのスクリーニングへの関心は、DNAマイクロアレイと}ヒトゲノムプロジェクト によるゲノミクスの成果の結果としてのみ生まれました。

最初のアレイアプローチは、通常 96 ウェル マイクロタイター プレートで行われる生化学および免疫生物学的アッセイを小型化しようとしたものです。96 ウェル プレート ベースの抗体アレイはハイスループット機能を備えていますが、各ウェルの表面積が小さいため抗体スポットの数が制限され、検出される分析物の数も制限されます。その後、ガラス スライドやニトロセルロース膜などの他の固体支持体が、より大きな抗体パネルを収容できるアレイの開発に利用されました。^[13]ニトロセルロース膜ベースのアレイは柔軟で扱いやすく、タンパク質結合容量も増加していますが、ハイスループットや自動処理には適していません。化学的に誘導体化されたガラス スライドを使用すると、サブ マイクロリットル サイズの抗体スポットを印刷できるため、スポット密度を犠牲にすることなくアレイの表面積を減らすことができます。これにより、消費されるサンプルの量も減ります。ガラス スライド ベースのアレイは、その滑らかで剛性の高い構造により、ハイスループットの液体処理システムにも簡単に取り付けることができます。

ほとんどの抗体アレイシステムでは、単一抗体（ラベルベース）検出と 2 抗体（サンドイッチベース）検出という 2 つの非競合的免疫検出法のうちの 1 つを採用しています。後者の方法で分析対象物を検出するには、2 つの異なる抗体（それぞれ固有のエピトープに結合する捕捉抗体とレポーター抗体）の結合が必要であり、ラベルベースの免疫検出（捕捉抗体は 1 つだけ使用し、開始サンプル内のすべてのタンパク質を化学的に標識することで検出）と比較して、より高い特異性とより低いバックグラウンド信号が得られます。サンドイッチベースの抗体アレイは、通常、あらゆるアレイ形式の中で最も高い特異性と感度（ng – pg レベル）を実現します。また、その再現性により定量分析も実行できます。^{[14] [15]}パネル内の他のすべての抗体と互換性のある一致する抗体ペアを開発するのは難しいため、小型アレイではサンドイッチアプローチが使用されることがよくあります。逆に、単一抗体ラベルベースのアプローチを使用すると、高密度アレイをより低コストで開発するのが容易です。この方法では、特定の抗体の 1 セットが使用され、サンプル内のすべてのタンパク質が蛍光染料またはハプテンによって直接標識されます。

抗体ベースのアレイシステムの初期の用途には、IgGおよび特定のサブクラスの検出、^{[16] [17]}抗原の分析、^[18]組み換え抗体のスクリーニング、^{[19] [20]}酵母タンパク質キナーゼの研究、^[21]自己免疫抗体の分析、^[22]タンパク質間相互作用の調査などがありました。^{[23] [24] [25]}抗体アレイ技術を使用して生理学的サンプルから複数のサイトカインを同時に検出する最初のアプローチは、2001年にRuo-Pan Huangと同僚によって行われました。^[26]彼らのアプローチでは、Hybond ECLメンブレンを使用して、細胞培養の調整培地と患者の血清から24のサイトカインの小さなパネルを検出し、生理学的レベルでのサイトカイン発現をプロファイリングすることができました。 Huangはこの技術を採用して、平面抗体アレイを初めて商品化したRayBiotech, Inc.という新しいビジネスを立ち上げました。

過去10年間で、表面化学の最適化と化学標識の専用プロトコルによって、この方法の感度が向上しました。^[27]現在、抗体アレイの感度はELISAに匹敵し、^{[28] [29]} 抗体アレイは、組織サンプル、血漿または血清サンプル、その他多くのサンプルタイプのプロファイリング実験に定期的に使用されています。抗体アレイに基づくプロファイリング研究の主な焦点の1つは、特に癌のバイオマーカーの発見です。^{[30] [31] [32] [33] [34]}がん関連の研究では、810種類のがん関連抗体を含む抗体アレイの開発と応用が2010年に報告されました。^[35]また、2010年には、507種類のサイトカイン、ケモカイン、アディポカイン、成長因子、血管新生因子、プロテアーゼ、可溶性受容体、可溶性接着分子、その他のタンパク質を含む抗体アレイが卵巣がん患者と健康な人の血清のスクリーニングに使用され、正常サンプルとがんサンプルの間でタンパク質発現に有意な差があることがわかりました。^[36]最近では、抗体アレイは、神経膠腫と関連しており、診断の何年も前にリスクを軽減できる特定のアレルギー関連血清タンパク質の特定に役立っています。^[37]抗体アレイによるタンパク質プロファイリングは、がん研究以外の分野、特にアルツハイマー病などの神経疾患でも効果があることが証明されています。アルツハイマー病患者を区別できるバイオマーカーパネルを特定しようとする研究は数多くあり、その多くは抗体アレイをこのプロセスで使用しています。Jaeger 氏らは、アルツハイマー病で影響を受ける生物学的経路とネットワークを発見するために、約 600 種類の循環タンパク質を測定し、それらの個々のタンパク質とネットワークのレベルとアルツハイマー病患者の認知能力との正負の関係を調査しました。^[38]現在、市販されている最大のサンドイッチベースの抗体アレイは、1000 種類の異なるタンパク質を検出します。^[39]さらに、抗体マイクロアレイベースのタンパク質プロファイリング サービスでは、1030 種類のタンパク質のタンパク質存在量とタンパク質リン酸化またはユビキチン化状態を並行して分析できます。^[40]

抗体アレイは、多くのサンプルタイプからのタンパク質発現を検出するためによく使用されますが、さまざまな調製法によるサンプルでも使用されます。Jiang 氏らは、血清と乾燥血液スポットという 2 つの異なる血液調製法におけるアレイタンパク質発現の相関関係をわかりやすく示しました。^[41]これらの異なる血液サンプル調製法は、サンドイッチベース、定量的、ラベルベースの 3 つの抗体アレイ プラットフォームを使用して分析され、タンパク質発現に強い相関関係が見られました。これは、特に入院していない公衆衛生分野で血液を採取するより便利で安全で安価な手段である乾燥血液スポットが、抗体アレイ分析と併用してバイオマーカーの発見、タンパク質プロファイリング、疾患のスクリーニング、診断、治療に効果的に使用できることを示唆しています。

抗体マイクロアレイは、さまざまな医療診断分野で利用されており、研究者の注目を集めています。デジタルバイオアッセイは、そのような研究分野の一例です。この技術では、ガラス/ポリマーチップ上のマイクロウェルのアレイに磁気ビーズ（蛍光標識抗体でコーティング）を播種し、標的抗原にさらした後、蛍光を発するウェルを数えることで顕微鏡で特性評価します。このようなマイクロウェルアレイ用のコスト効率の高い製造プラットフォーム（OSTEポリマーを使用）が最近実証され、バイオアッセイモデルシステムの特性評価に成功しました。^[42]さらに、チオールエン「合成紙」マイクロピラースキャフォールドでの免疫アッセイは、優れた蛍光信号を生成することが示されています。^[43]

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