パッチクランプ

パッチクランプ法は、電気生理学の実験技術であり、個々の単離された生体細胞、組織切片、または細胞膜のパッチにおけるイオン電流を研究するために使用されます。この技術は、ニューロン、心筋細胞、筋繊維、膵臓ベータ細​​胞などの興奮性細胞の研究に特に有用であり、特別に調製された巨大スフェロプラスト内の細菌イオンチャネルの研究にも適用できます。

パッチクランプ法は、電圧クランプ法を使用して実行できます。この場合、細胞膜を横切る電圧は実験者によって制御され、結果として生じる電流が記録されます。あるいは、電流クランプ法を使用することもできます。この場合、膜を通過する電流は実験者によって制御され、結果として生じる電圧の変化が、通常は活動電位の形で記録されます。

エルヴィン・ネーハーとバート・ザックマンは、1970年代後半から1980年代初頭にかけてパッチクランプを開発しました。この発見により、初めて単一のイオンチャネル分子の電流を記録できるようになり、活動電位や神経活動などの基本的な細胞プロセスにおけるチャネルの関与についての理解が深まりました。ネーハーとザックマンは、この研究により1991年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。^[1]

パッチクランプ記録中、電解質溶液で満たされたマイクロピペットまたはパッチピペットと呼ばれる中空のガラス管と、増幅器に接続された記録電極が、単離された細胞 の膜に接触します。別の電極は、参照接地電極として、細胞または組織を囲む浴槽に配置されます。記録電極と参照電極の間に、目的の細胞を挟んで電気回路を形成できます。

パッチピペットに充填する溶液は、細胞付着記録の場合のように浴溶液のイオン組成と一致するか、または細胞全体の記録の場合は細胞質と一致する可能性があります。浴溶液内の溶液は、実行する実験に応じて、生理学的細胞外溶液、細胞質と一致するか、または完全に非生理学的である可能性があります。研究者は、イオンまたは薬剤を追加して浴溶液（またはあまり一般的ではないがピペット溶液）の内容を変更し、さまざまな条件下でイオンチャネルを研究することもできます。

研究者が測定しようとしているものに応じて、使用されるピペットチップの直径は異なりますが、通常はマイクロメートルの範囲です。^{[2]この小さなサイズは、}細胞膜の表面領域または「パッチ」を囲むために使用されます。これには、多くの場合、1つまたは数個のイオンチャネル分子のみが含まれます。^{[3]このタイプの電極は、従来の}細胞内記録で細胞を穿刺するために使用される「鋭い微小電極」とは異なり、細胞膜に挿入されるのではなく、細胞膜の表面に密封されます。

いくつかの実験では、マイクロピペットの先端をマイクロフォージで加熱して滑らかな表面を作り、細胞膜との高抵抗シールの形成を助けます。この高抵抗シールを得るには、マイクロピペットを細胞膜に押し付けて吸引します。細胞膜の一部がピペットに吸引され、オメガ型の膜領域が形成されます。これが適切に形成されると、10～100ギガオームの範囲の抵抗が生じ、「ギガオームシール」または「ギガシール」と呼ばれます。^[3]このシールの高抵抗により、膜パッチ全体で測定された電流をほとんど競合ノイズなしで電子的に分離することができ、記録にいくらかの機械的安定性がもたらされます。^[4]

多くのパッチクランプアンプは真の電圧クランプ回路を使用せず、代わりにバス電極を使用してゼロ電流（グランド）レベルを設定する差動アンプです。これにより、研究者は電流の変化を観察しながら電圧を一定に保つことができます。これらの記録を行うには、パッチピペットをグランド電極と比較します。次に、一定の設定電圧を維持するために電流がシステムに注入されます。電圧をクランプするために必要な電流は、膜を通過する電流と符号が反対で、大きさが等しくなります。^[3]

あるいは、細胞を全細胞モードで電流クランプし、膜電圧の変化を観察しながら電流を一定に保つこともできる。^[5]

パッチクランプ法に加えて、コンプレストーム、ビブラトーム、ミクロトームによる正確な組織切片作成 が不可欠です。これらのデバイスは、薄く均一な組織切片を提供することで、最適な電極埋め込みを実現します。正確で信頼性の高い記録を保証する方法でパッチクランプ研究用の組織を準備するために、研究者は柔らかい組織にはビブラトーム、硬い組織にはミクロトームを使用するように選択できます。 ^[6] Leica Biosystems、Carl Zeiss AGは、これらのデバイスの有名な製造元です。

研究者が研究したい内容に応じて、基本技術のいくつかのバリエーションを適用できます。内側から外側への技術と外側から外側への技術は、パッチが細胞本体から切除 (除去) されるため、「切除パッチ」技術と呼ばれます。細胞接着型および両方の切除パッチ技術は、電極に取り付けられた膜の部分にある個々のイオン チャネルの動作を研究するために使用されます。

全細胞パッチと穿孔パッチにより、研究者は単一チャネル電流ではなく、細胞全体の電気的挙動を研究することができます。細胞内部への低抵抗の電気的アクセスを可能にする全細胞パッチは、現在、細胞膜全体の電流を記録する高抵抗の微小電極記録技術に大きく取って代わっています。

この方法では、ピペットを細胞膜に密着させてギガシール（ギガオーム程度の電気抵抗を持つシール）を作り、細胞膜が損傷を受けないようにします。これにより、ピペットで捕捉された膜パッチに含まれる単一または少数のイオンチャネルを流れる電流を記録できます。細胞膜の外側にのみ付着するため、細胞構造が乱れることはほとんどありません。^[3]また、細胞の内部を破壊しないことで、通常チャネルに影響を与える細胞内メカニズムは、生理学的に機能することができます。^[7]この方法を使用すると、適切な構成を得るのも比較的簡単で、一度得られるとかなり安定します。^[8]

リガンド依存性イオンチャネルまたは代謝調節型受容体によって調節されるチャネルの場合、研究対象の神経伝達物質または薬物は通常ピペット溶液に含まれており、そこで膜のかつての外部表面と相互作用する可能性があります。結果として生じるチャネルの活動は、使用されている薬物に起因する可能性がありますが、通常、ピペット内の薬物濃度を変更することは不可能です。したがって、この技術は、パッチごとに用量反応曲線の1つのポイントに制限されます。したがって、用量反応は、複数の細胞とパッチを使用して達成されます。ただし、電位依存性イオンチャネルは、単一のパッチで異なる膜電位で連続的にクランプできます。これにより、電圧の関数としてチャネルが活性化され、完全なIV（電流-電圧）曲線は1つのパッチでのみ確立できます。この技術のもう1つの潜在的な欠点は、細胞の細胞内経路が妨げられないのと同様に、それらを直接変更することもできないことです。^[8]

インサイドアウト法では、膜のパッチをパッチピペットに取り付け、細胞の残りの部分から切り離し、膜の細胞質表面を外部媒体または浴にさらします。 ^[9]この方法の利点の1つは、実験者が浴を介して膜の細胞内表面にアクセスし、膜の内側表面がさらされているものの化学組成を変更できることです。これは、実験者が単一のイオンチャネルの細胞内表面の環境を操作したい場合に便利です。たとえば、細胞内リガンドによって活性化されるチャネルを、さまざまなリガンド濃度で研究することができます。

インサイドアウト構成を実現するには、ピペットを細胞接着モードと同様に細胞膜に接着してギガシールを形成し、その後引き戻して膜のパッチを細胞の残りの部分から切り離します。膜パッチを引き離すと、パッチ膜の端が切除後すぐに融合するため、ピペットの先端に膜の小胞が形成されることがよくあります。次に、小胞の外面を破ってインサイドアウトモードにする必要があります。これは、膜をバス溶液/空気界面に短時間通すか、低Ca ²⁺溶液にさらすか、パラフィンの液滴または硬化したシリコーンポリマー片と瞬間的に接触させることによって行うことができます。^[10]

全細胞記録では、細胞膜の広い領域にわたって、複数のチャネルに流れる電流を同時に記録します。細胞接着記録の場合と同様に、電極は細胞上に残されますが、膜パッチを破るためにより強い吸引力が加えられ、ピペットの内部から細胞の細胞内空間へのアクセスが可能になります。これにより、治療（薬剤など）が細胞にリアルタイムでどのように影響するかを管理および研究する手段が提供されます。 ^[11]ピペットが細胞膜に取り付けられると、パッチを破壊する方法が2つあります。1つ目は、より強い吸引力をかけることです。この吸引の量と持続時間は、細胞の種類とピペットのサイズによって異なります。もう1つの方法では、大きな電流パルスをピペットに送る必要があります。適用される電流の量とパルスの持続時間も、細胞の種類によって異なります。^[8]一部の種類の細胞では、パッチを破壊するために両方の方法を同時に適用すると便利です。

鋭い電極技術記録に対する全細胞パッチクランプ記録の利点は、パッチクランプ電極の先端の開口部が大きいため抵抗が低く、細胞内部への電気的アクセスが向上することです。^{[12] [11]}この技術の欠点は、電極の容積が細胞の容積より大きいため、細胞内部の可溶性内容物が徐々に電極の内容物に置き換わってしまうことです。これは、電極が細胞内容物を「透析」していると呼ばれます。 ^[8]しばらくすると、可溶性細胞内内容物に依存する細胞の特性が変わります。使用されるピペット溶液は通常、細胞内部の高カリウム環境に近いもので、これが引き起こす可能性のある変化を最小限に抑えます。全細胞記録の開始時には、細胞が透析される前に測定できる期間がしばしばあります。^[8]

「アウトサイドアウト」という名前は、この技術がインサイドアウト技術を補完するものであるということと、パッチ電極との関係において、細胞膜の細胞内表面ではなく外部表面を膜パッチの外側に配置するという事実の両方を強調しています。^[7]

アウトサイドアウトパッチの形成は、細胞全体の記録構成から始まります。細胞全体の構成が形成された後、電極はゆっくりと細胞から引き抜かれ、膜の球が細胞から飛び出します。電極を十分に引き離すと、この球は細胞から分離し、電極の端に凸状の膜として再形成されます（電極の先端が開いたボールのように）。膜の元の外側は電極の外側を向きます。^[7]右の図が示すように、これはピペット内の液体が細胞内液をシミュレートし、研究者はピペットとチャネル付きの球を別の溶液槽に自由に移動できることを意味します。膜の球には複数のチャネルが存在する可能性がありますが、分離した膜の球が小さく、チャネルが 1 つしかない場合は、この構成で単一チャネルの記録も可能です。^[13]

アウトサイドアウトパッチ法では、イオンチャネルを細胞から分離し、膜の細胞外表面でさまざまな溶液に連続的にさらした場合の特性を調べることができます。 実験者は、比較的短時間で同じパッチにさまざまな溶液を灌流することができ、チャネルが細胞外面の神経伝達物質または薬物によって活性化された場合、用量反応曲線を得ることができます。^[14]異なる溶液中のまったく同じ膜片を通過する電流を測定できるというこの能力は、細胞接着法と比較したアウトサイドアウトパッチの明確な利点です。 一方、達成はより困難です。 形成プロセスが長くなると、失敗する可能性のあるステップが増え、使用可能なパッチの頻度が低くなります。

パッチクランプ法のこのバリエーションは、全細胞構成と非常によく似ています。主な違いは、実験者がギガオームシールを形成するときに、パッチ膜を破るために吸引が使用されないという事実にあります。代わりに、電極溶液には、アムホテリシンB、ナイスタチン、またはグラミシジンなどの抗真菌剤または抗生物質が少量含まれており、これが膜パッチに拡散して膜に小さな孔を形成し、細胞内部への電気的アクセスを提供します。^[15]全細胞法と穿孔パッチ法を比較する場合、全細胞パッチは、ピペット溶液と細胞質の分子の間で完全な交換が行われる開いたドアと考えることができます。穿孔パッチは、ピペット溶液から細胞の細胞質への特定の分子の交換のみを許可する網戸に例えることができます。

全細胞記録と比較した穿孔パッチ法の利点には、抗生物質細孔の特性が挙げられ、この特性により、パッチピペットと細胞質の間で小さな一価イオンのみが平衡化され、細孔を透過できない大きな分子は平衡化されない。この特性により、Ca ^{2+などの二価イオンや}cAMPなどのシグナル伝達分子の内因性レベルが維持される。その結果、全細胞パッチクランプのように細胞全体の記録が可能になり、同時に細胞付着記録のようにほとんどの細胞内シグナル伝達メカニズムが保持される。その結果、電流の減少が減り、安定した穿孔パッチ記録が 1 時間以上続く。^[15]欠点には、部分的な膜が電極の先端を占有するため、全細胞に比べてアクセス抵抗が高くなることがある。これにより、電流分解能が低下し、記録ノイズが増加する可能性がある。また、抗生物質が膜を貫通するのにかなりの時間がかかることがあります（アムホテリシンBの場合は約15分、グラミシジンとナイスタチンの場合はさらに長い時間）。電極先端の下の膜は抗生物質によって形成された穿孔によって弱くなり、破裂する可能性があります。パッチが破裂すると、記録は全細胞モードになり、抗生物質が細胞の内部を汚染します。^[15]

ルーズパッチクランプは、従来の技術で使用されるタイトなギガシールではなく、緩いシール（低電気抵抗）を使用する点で、ここで説明する他の技術とは異なります。この技術は、筋細胞の表面のインピーダンスに関するStrickholmの論文に記載されているように、1961年には早くも使用されていましたが^[16 ]、パッチクランプが電気生理学の主要なツールとして確立された後、1982年にAlmers、Stanfield、およびStühmerによって再び取り上げられ、名前が付けられるまで、ほとんど注目されませんでした ^{[17] 。}

細胞膜上で緩いパッチクランプを行うには、細胞とピペットの接触による電気抵抗が、電極のみの場合よりも数倍大きくなるまで、ピペットを細胞に向かってゆっくり動かします。ピペットが細胞膜に近づくほど、ピペットの先端の抵抗は大きくなりますが、近づきすぎるとシールができてしまい、細胞を損傷せずにピペットを取り外すことが難しくなる可能性があります。緩いパッチ技術では、ピペットは細胞膜に十分近づかないため、ギガシールや永久接続が形成されることはなく、細胞膜を突き刺すこともありません。^[18]細胞膜は無傷のままで、密閉されていないため、イオンがピペットに入らずに細胞の外に通過できる小さな隙間ができます。

ルーズシールの大きな利点は、記録後に使用したピペットをメンブレンから繰り返し取り外すことができ、メンブレンが無傷のままであることです。これにより、メンブレンの完全性を損なうことなく、同じセルのさまざまな場所で繰り返し測定できます。この柔軟性は、実際の生理学的条件下で収縮する筋細胞を研究し、筋繊維の収縮を止めるための極端な手段に頼ることなく、迅速に記録を取得する研究者にとって特に便利です。^[17]大きな欠点は、ピペットとメンブレンの間の抵抗が大幅に減少し、シールを通して電流が漏れ、小さな電流の解像度が大幅に低下することです。ただし、この漏れは部分的に補正できるため、対象のセルのさまざまな領域から行われた記録を比較対照することができます。これを考慮すると、ルーズパッチ技術は 1 mA/cm ²未満の電流を分解できると推定されています。^[18]

細胞イメージング、RNAシーケンシング、パッチクランプを組み合わせたこの方法は、複数のモダリティにわたってニューロンを完全に特徴付けるために使用されます。^{[19]神経組織は}トランスクリプトーム 的に最も多様な細胞集団の1つであるため、ニューロンが形成する回路を理解するためにニューロンを細胞タイプに分類することは、神経科学者にとって大きな課題です。従来の分類方法と単一細胞RNAシーケンシングを事後的に組み合わせることは困難で時間がかかることが証明されています。電気生理学、シーケンシング、顕微鏡検査などの複数のデータモダリティを組み合わせることで、Patch-seqはニューロンを同時に複数の方法で特徴付けることを可能にします。 現在、ニューロンのパッチクランプ記録を成功させるには手作業が必要であるため、他のシーケンシング方法と比較してスループットが低いという問題があります。 現在、パッチクランプ技術を自動化する調査が進行中であり、これによりパッチシークエンスのスループットも向上します。^[20]

大量のデータを低コストで短時間に収集するために、自動パッチクランプシステムが開発されました。このようなシステムには、通常、細胞を捕捉するための使い捨てのマイクロ流体デバイス (射出成形またはポリジメチルシロキサン(PDMS) 鋳造チップ) と統合電極が含まれます。

このような自動化システムの 1 つの形態では、圧力差を利用して、研究対象の細胞をピペットの開口部に向かって引き寄せ、ギガシールを形成します。次に、ピペットの先端を大気に短時間さらすと、ピペットから突き出ている膜の部分が破裂し、膜はピペットの先端で裏返しの構造になります。完全に自動化されたシステムでは、ピペットと膜パッチを一連の異なるテスト溶液に素早く移動させ、記録中にさまざまなテスト化合物を膜の細胞内側に塗布することができます。^[20]

• 軸索ガイド - 電気生理学および生物物理学の実験技術
• パッチクランプのバリエーションの代替画像
• パッチクランプ法のアニメーション 2017-01-30 にWayback Machineでアーカイブされました