マイクロペプチド

潜在的なsORF、ひいてはマイクロペプチドを見つける方法の一つに、RNAシーケンス（RNA-Seq）があります。RNA-Seqは、次世代シーケンシング（NGS）を用いて、特定の時点において特定の細胞、組織、または生物で発現しているRNAを決定します。トランスクリプトームとして知られるこのデータ群は、潜在的なsORFを見つけるためのリソースとして使用できます。^{[ 1 ]} 100アミノ酸未満のsORFが偶然に発生する可能性が非常に高いため、この方法で得られたデータの妥当性を判断するには、さらなる研究が必要です。^{[ 11 ]}

リボソームプロファイリングは、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ヒトなど、ますます多くの生物で潜在的なマイクロペプチドを同定するために使用されてきました。^{[ 11 ]} 1つの方法は、ハリントニン、ピューロマイシン、ラクチミドマイシンなどの化合物を使用して、翻訳開始部位でリボソームを停止させます。^{[ 12 ]}これにより、活発な翻訳が行われている場所が示されます。エメチンやシクロヘキシミドなどの翻訳伸長阻害剤も、翻訳されたORFが得られる可能性が高いリボソームフットプリントを取得するために使用できます。^{[ 13 ]}リボソームがsORFまたはその近くに結合している場合、それは推定上マイクロペプチドをコードしています。^{[ 1 ] [ 2 ] [ 14 ]}

質量分析法（MS）は、タンパク質の同定と配列決定における標準的な手法である。この技術を用いることで、研究者はポリペプチドが実際にsORFから翻訳されたものかどうかを判断することができる。

プロテオゲノミクスは、プロテオミクス、ゲノミクス、トランスクリプトミクスを組み合わせたものです。これは、潜在的なマイクロペプチドを探す際に重要です。プロテオゲノミクスを使用する方法の1つは、RNA-Seqデータを使用して、考えられるすべてのポリペプチドのカスタムデータベースを作成することです。液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析（LC-MS/MS）を実行して、翻訳産物の配列情報を取得します。トランスクリプトミクスデータとプロテオミクスデータを比較することで、マイクロペプチドの存在を確認できます。^{[ 1 ] [ 2 ]}

系統発生的保存は、特に大規模な sORF データベースを精査する際に有用なツールとなり得る。sORF が機能的なマイクロペプチドを生成する可能性は、それが多数の種にわたって保存されている場合に高くなる。^{[ 11 ] [ 12 ]}ただし、これはすべての sORF に当てはまるわけではない。例えば、lncRNA によってコードされる sORF は、lncRNA 自体の配列保存性が高くないため、保存される可能性は低い。^{[ 2 ]}実際に機能的なマイクロペプチドが生成されるかどうかを判断するには、さらなる実験が必要となる。

目的のマイクロペプチドを標的とするカスタム抗体は、発現量を定量化したり、細胞内局在を決定したりするのに役立ちます。ほとんどのタンパク質の場合と同様に、発現量が低いと検出が困難になる場合があります。マイクロペプチドのサイズが小さいことも、抗体の標的となるエピトープの設計を困難にする可能性があります。 ^{[ 2 ]}

ゲノム編集は、内因性sORFにFLAG/MYCやその他の小さなペプチドタグを追加して融合タンパク質を作成するために使用できます。ほとんどの場合、この方法はカスタム抗体を開発するよりも迅速に実行できるため有益です。また、標的とするエピトープがないマイクロペプチドにも有用です。^{[ 2 ]}

このプロセスでは、全長マイクロペプチドcDNAをT7またはSP6プロモーターを含むプラスミドにクローニングします。この方法は、 ^35S-メチオニンの存在下で無細胞タンパク質合成システムを利用して目的のペプチドを生成します。その後、生成物をゲル電気泳動で分析し、^35S標識ペプチドをオートラジオグラフィーで可視化します。^{[ 2 ]}

大腸菌で発現するマイクロペプチドは、細菌の環境適応の一例である。これらのほとんどは、リーダーペプチド、リボソームタンパク質、毒性タンパク質の3つのグループに分類されている。リーダータンパク質は、アミノ酸が不足しているときに、アミノ酸代謝に関与するタンパク質の転写および/または翻訳を調節する。リボソームタンパク質には、50Sリボソームサブユニットの2つの構成要素であるL36（rpmJ）とL34（rpmH）が含まれる。ldrDなどの毒性タンパク質は、高濃度では毒性があり、細胞を殺したり、成長を阻害したりすることができ、宿主細胞の生存率を低下させる機能を持つ。^{[ 21 ]}

サルモネラ菌（S. enterica）では、 MgtC病原性因子が低マグネシウム環境への適応に関与している。疎水性ペプチドMgrRはMgtCに結合し、FtsHプロテアーゼによる分解を引き起こす。^{[ 9 ]}

枯草菌によって発現される46アミノ酸のSdaマイクロペプチドは、複製開始が阻害されると胞子形成を抑制する。SdaはヒスチジンキナーゼKinAを阻害することで、胞子形成に必要な転写因子Spo0Aの活性化を阻害する。^{[ 10 ]}

黄色ブドウ球菌には、宿主感染中に分泌され好中球膜を破壊して細胞溶解を引き起こす20～22アミノ酸のマイクロペプチド群が存在する。これらのマイクロペプチドにより、細菌はヒト免疫系の主要な防御機構による分解を回避できる。^{[ 22 ] [ 23 ]}

POLARIS (PLS)遺伝子は 36 アミノ酸のマイクロペプチドをコードしています。これは、葉の維管束の適切なパターン形成と根の細胞伸長に必要です。このマイクロペプチドは、発生中の PIN タンパク質と相互作用して、オーキシン、エチレン、サイトカイニン間のホルモンクロストークのための重要なネットワークを形成します。^{[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]}

シロイヌナズナのROTUNDIFOLIA（ROT4）は、葉細胞の形質膜に局在する53アミノ酸のペプチドをコードしている。ROT4の機能のメカニズムはよく理解されていないが、変異体は短く丸い葉を持つことから、このペプチドが葉の形態形成において重要である可能性が示唆されている。^{[ 27 ]}

Brick1 (Brk1) は、植物と動物の両方で高度に保存されている 76 アミノ酸のマイクロペプチドをコードしています。Z . mays では、発達中の葉の表皮で複数のアクチン依存性細胞極性イベントを促進することにより、葉の上皮の形態形成に関与していることがわかりました。^{[ 28 ]} Zm401p10 は 89 アミノ酸のマイクロペプチドで、タペートムでの正常な花粉の発達に役割を果たしています。有糸分裂後には、タペートムの分解にも不可欠です。^{[ 29 ]} Zm908p11 は、成熟した花粉粒で発現するZm908遺伝子によってコードされる 97 アミノ酸長のマイクロペプチドです。花粉管の細胞質に局在し、その成長と発達を助けます。^{[ 30 ]}

進化的に保存されているポリッシュドライス（pri）遺伝子は、ショウジョウバエではtarsal-less（tal）として知られており、表皮分化に関与している。このポリシストロン転写産物は、長さが11～32アミノ酸の4つの類似したペプチドをコードしている。これらのペプチドは、転写因子Shavenbaby （Svb）を切断する機能を持つ。これにより、Svbは活性化因子に変換され、ミニチュア（m）やシェイブノイド（sha）などの標的エフェクターの発現を直接制御する。これらのエフェクターは、トリコーム形成に関与している。^{[ 31 ]}

Elabela遺伝子（Ela）（別名Apela、Toddler）は胚発生に重要である。^{[ 32 ]}これは特に後期胞胚期と原腸胚期に発現する。原腸形成期には、中胚葉内胚葉細胞の内在化と動物極方向への移動を促進する上で重要である。原腸形成後、Elaは側方中胚葉、内胚葉、および前部と後部の脊索で発現する。ゼブラフィッシュ、マウス、ヒトではlncRNAとして注釈付けされているが、58アミノ酸のORFは脊椎動物種間で高度に保存されていることが判明している。ElaはN末端シグナルペプチドの除去によって処理され、細胞外空間に分泌される。その34アミノ酸の成熟ペプチドは、アペリン受容体として知られるGPCRの最初の内因性リガンドとして機能する。^{[ 33 ] [ 32 ]}ゼブラフィッシュのElaまたはAplnrの遺伝的不活性化は、心臓のない表現型をもたらします。^{[ 34 ] [ 35 ]}

ミオレグリン（Mln）は、もともとlncRNAとして注釈付けされた遺伝子によってコードされています。Mlnは3種類の骨格筋すべてで発現しており、心筋のマイクロペプチドであるホスホランバン（Pln）や遅筋（I型）骨格筋のサルコリピン（Sln）と同様の働きをします。これらのマイクロペプチドは、筋小胞体（SR）へのCa2 ⁺取り込みを調節する膜ポンプである筋小胞体Ca2 ⁺ -ATPase （SERCA）と相互作用します。これらのマイクロペプチドは、SRへのCa2 ^{+取り込みを阻害することで、筋弛緩を引き起こします。同様に、}エンドレグリン（ELN）遺伝子とアナザーレグリン（ALN）遺伝子は、SERCA結合モチーフを含む膜貫通型マイクロペプチドをコードしており、哺乳類で保存されています。^{[ 7 ]}

Myomixer (Mymx) は、長さ 84 アミノ酸の筋肉特異的ペプチドであるGm7325遺伝子によってコードされており、胚発生中に融合と骨格筋形成において役割を果たします。これは細胞膜に局在し、融合促進膜タンパク質であるMyomaker (Mymk) と結合します。ヒトでは、Mymx をコードする遺伝子は未特徴のLOC101929726として注釈されています。オルソログは、カメ、カエル、魚類のゲノムにも見られます。^{[ 8 ]}

ヒトでは、NoBody（非注釈Pボディ解離ポリペプチド）は、68アミノ酸からなるマイクロペプチドで、長鎖介在非コードRNA（lincRNA）LINC01420で発見された。哺乳類間で配列保存性が高く、Pボディに局在する。5 ' mRNA脱キャップに関与するタンパク質を濃縮する。mRNA脱キャップエンハンサー4 （EDC4）と直接相互作用すると考えられている。^{[ 36 ]}

ELABELA（ ELA）（別名APELA）は、ヒト胚性幹細胞から32アミノ酸のマイクロペプチドとして分泌される内因性ホルモンである。 ^{[ 32 ]}ヒト胚性幹細胞の 自己複製能と多能性を維持するために不可欠である。まだ特定されていない細胞表面受容体を介してPI3/AKT経路を介して自己分泌的にシグナル伝達を行う。 ^{[ 37 ]}分化中の中胚葉細胞では、ELAはAPLNRに結合し、 APLNRを介してシグナル伝達を行う。APLNRはホルモンペプチドAPLNにも反応するGPCRである。

哺乳類で保存されているCYREN遺伝子は、選択的スプライシングによって3つのマイクロペプチドを生成すると予測されている。MRI-1は、以前にレトロウイルス感染の調節因子であることが判明している。予測される2番目のマイクロペプチドであるMRI-2は、 DNA二本鎖切断の非相同末端結合（NHEJ）において重要である可能性がある。共免疫沈降実験では、MRI-2はNHEJ経路で主要な役割を果たすKuの2つのサブユニットであるKu70とKu80に結合した。 ^{[ 38 ]}

24個のアミノ酸からなるマイクロペプチドであるヒューマニン（HN）は、アポトーシス誘導タンパク質であるBcl2関連Xタンパク質（Bax）と相互作用する。活性状態のBaxは、膜標的ドメインを露出させる構造変化を起こす。これにより、Baxは細胞質からミトコンドリア膜に移動し、そこで挿入されてシトクロムcなどのアポトーシス誘導タンパク質を放出する。HNはBaxと相互作用することで、Baxのミトコンドリアへの標的化を阻害し、それによってアポトーシスをブロックする。^{[ 39 ]}

90アミノ酸からなるマイクロペプチド「アミノ酸応答性小型調節ポリペプチド」またはSPAARは、lncRNA LINC00961にコードされていることがわかった。これはヒトとマウスの間で保存されており、後期エンドソーム/リソソームに局在する。SPAARはv-ATPase複合体の4つのサブユニットと相互作用し、mTORC1が活性化されるリソソーム表面への移行を阻害する。このマイクロペプチドのダウンレギュレーションにより、アミノ酸刺激によるmTORC1の活性化が可能になり、筋肉再生が促進される。^{[ 40 ]}