無細胞タンパク質合成

無細胞タンパク質合成は、 in vitro タンパク質合成またはCFPSとも呼ばれ、無細胞システム、つまり生きた細胞を使用せずに生物学的機構を使用してタンパク質を生産することです。in vitroタンパク質合成環境は、細胞壁や細胞生存を維持するために必要な恒常性条件によって制約されません。^{[1]したがって、CFPSは}翻訳環境 への直接アクセスと制御を可能にし、膜タンパク質の共翻訳可溶化、タンパク質生産の最適化、非天然アミノ酸の組み込み、選択的および部位特異的な標識付けなど、多くの用途に有利です。^{[2] [3]}システムのオープンな性質により、pH、酸化還元電位、温度、シャペロンなどのさまざまな発現条件をスクリーニングできます。細胞生存を維持する必要がないため、毒性タンパク質が生成されることがあります。

無細胞反応の一般的な構成要素には、細胞抽出物、エネルギー源、アミノ酸の供給、マグネシウムなどの補因子、および目的の遺伝子を含むDNAが含まれます。細胞抽出物は、目的の細胞を溶解し、細胞壁、DNAゲノム、およびその他の残骸を遠心分離して除去することによって得られます。残っているのは、リボソーム、アミノアシル tRNA 合成酵素、翻訳開始因子および伸長因子、ヌクレアーゼなど の必要な細胞機構です。

CFPS では、プラスミドと線形発現テンプレート (LET)の 2 種類の DNA を使用できます。プラスミドは環状で、細胞内でのみ生成されます。LET は、インキュベーターで細胞を育てるよりもはるかに速く DNA を複製するPCRによって、はるかに効率的に生成できます。LET はより簡単かつ迅速に作成できますが、プラスミドの収量は通常、CFPS ではるかに高くなります。このため、今日の多くの研究は、CFPS LET 収量を最適化して、プラスミドを使用した CFPS の収量に近づけることに焦点が当てられています。

エネルギー源は無細胞反応の重要な部分です。通常、必要なエネルギー源とアミノ酸の供給を含む別の混合物が、反応の抽出物に加えられます。一般的なエネルギー源は、ホスホエノールピルビン酸、アセチルリン酸、クレアチンリン酸です。

CFPSは、従来の生体内タンパク質合成に比べて多くの利点があります。最も注目すべきは、抽出液の調製を含む無細胞反応は通常1～2日かかるのに対し、生体内タンパク質発現には1～2週間かかる場合があることです。^{[4] [5] [6] [7]}

CFPS はオープン反応です。細胞壁がないため、化学環境を直接操作できます。サンプルの採取は簡単で、濃度を最適化し、反応を監視できます。対照的に、DNA が生細胞に挿入されると、反応が終了して細胞が溶解するまで反応にアクセスすることはできません。

CFPSのもう一つの利点は、毒性の心配がないことです。目的のタンパク質や標識タンパク質の中には、合成時に細胞に毒性を示すものがあります。^[8] 生きた細胞を使用しないため、生成タンパク質の毒性は大きな懸念事項ではありません。

これらの利点により、多くの用途が可能になります。^{[9] [1] CFPSの主な用途は、}タンパク質構造への非天然アミノ酸の組み込みです（拡張遺伝暗号を参照）。反応の開放性は、このような反応に必要な 修飾tRNAと非天然アミノ酸を挿入するのに最適です。

合成生物学は、タンパク質の進化、ナノマシン、核酸回路、ワクチンや薬物療法のためのウイルス様粒子の合成など、他の多くの用途があり、明るい未来が期待されています。^{[10] [11] [12]}

CFPS に関連する課題の 1 つは、細胞抽出物中の内因性ヌクレアーゼによる DNA の分解です。これは LET の場合に特に問題となります。細胞にはDNA 鎖のランダムな部位を攻撃するエンドヌクレアーゼがありますが、末端から DNA を攻撃するエキソヌクレアーゼの方がはるかに一般的です。プラスミドは環状でエキソヌクレアーゼが付着する末端がないため、後者の影響を受けません。ただし、LET は両方の影響を受けます。LET の脆弱性のため、今日多くの研究は、プラスミドを使用して CFPS の LET 収量を CFPS の収量に近づけるために最適化することに焦点を当てています。

プラスミドによるこの改善された保護の一例は、バクテリオファージラムダ gamタンパク質の使用である。^{[13] Gamは}大腸菌（E. coli）に見られるエキソヌクレアーゼであるRecBCDの阻害剤である。 ^[14] gamの使用により、LETによるCFPS収量が大幅に増加し、プラスミドによるCFPS収量に匹敵するようになった。^[15]エキソヌクレアーゼの懸念を排除した純粋な抽出物も作成できる。これらの抽出物は作成コストが高く、現時点では外因性DNA分解の問題に対する経済的な解決策ではない。

現在使用されている一般的な細胞抽出物は、大腸菌（ECE）、ウサギ 網状赤血球（RRL）、小麦胚芽（WGE）、昆虫細胞（ICE）、酵母クルイベロミセス（D2Pシステム）から作られています。^{[1] [5]}これらの抽出物はすべて市販されています。

ECEは、いくつかの理由から最も人気のある溶解物です。最も安価な抽出物であり、作成に最も時間がかかりません。また、大量の大腸菌を簡単に増殖させ、ホモジナイザーまたは超音波処理機を使用して簡単に溶解できます。^[1] ECEは、最高のタンパク質収量も提供します。ただし、高収量生産は、特に翻訳後修飾において、合成タンパク質の複雑さを制限する可能性があります。その点では、修飾酵素システムが抽出物中に維持されている限り、効率の低い真核生物システムが有利になる可能性があります。

それぞれの真核生物系には長所と短所があります。例えば、WGE抽出物は3つの真核生物抽出物の中で最も高い収量を生み出しますが、グリコシル化などの一部の翻訳後修飾にはそれほど効果的ではありません。^[5]抽出物を選択する際には、翻訳後修飾の種類、望ましい収量、およびコストを考慮する必要があります。

無細胞タンパク質合成は60年以上にわたって使用されており、特にコドンの最初の解明は1961年に国立衛生研究所のマーシャル・ニーレンバーグとハインリッヒ・J・マタイによって行われました。 ^{[1] [16]}彼らは無細胞システムを使用してポリウラシルRNA配列（生化学用語ではUUUUU...）を翻訳し、 合成したポリペプチドがアミノ酸のフェニルアラニンのみで構成されていることを発見しました。これにより、彼らはこのポリフェニルアラニンから、コドンUUUがアミノ酸のフェニルアラニンを指定していると推測しました。この研究を拡張して、ニーレンバーグと彼の同僚は各コドンのヌクレオチド構成を決定することができました。

• ニーレンバーグとマッセイの実験
• ポリメラーゼ連鎖反応の最適化

• Spirin, A.; Baranov, V.; Ryabova, L.; Ovodov, S.; Alakhov, Y. (1988). 「高収率でポリペプチドを生産できる連続無細胞翻訳システム」. Science . 242 (4882): 1162–4. Bibcode :1988Sci...242.1162S. doi :10.1126/science.3055301. PMID  3055301.

• Hartsough EM、Shah P、Larsen AC、Chaput JC (2015 年 9 月)。「真核生物の無細胞発現システムの比較分析」。BioTechniques . 59 ( 3): 149–51. doi : 10.2144/000114327 . PMID  26345507。