ウイルスの定量化

ウイルス定量とは、サンプル内のウイルス粒子（ビリオン）の数を数えたり計算したりして、ウイルス濃度を判定することです。これは、学術研究室や商業研究室での研究開発（R&D）だけでなく、さまざまな段階でのウイルス量が重要な変数として監視される生産現場でも使用されています。たとえば、ウイルスベースのワクチン、ウイルスベクターを使用した組み換えタンパク質、ウイルス抗原の生産では、製品の品質と生産量を最適化し、常に変化する需要と用途に対応するために、プロセスを継続的に監視および/または変更するために、ウイルス定量が必要です。ウイルスを定量する必要がある具体的な例としては、他に、クローンスクリーニング、感染多重度（MOI）の最適化、細胞培養への方法の適応などがあります。

ウイルス定量法を分類する方法は数多くあります。ここでは、測定対象と生物学的状況に応じて分類します。たとえば、細胞ベースのアッセイでは通常、感染単位（活性ウイルス）を測定します。他の方法では、ウイルスタンパク質、DNA、RNA、または分子粒子の濃度を測定しますが、必ずしも感染性を測定するわけではありません。各方法には独自の長所と短所があり、多くの場合、特定のアプリケーションにどの方法を使用するかが決まります。^[1]

プラークベースのアッセイは、感染量の観点からウイルス濃度を決定するために一般的に使用される方法です。プラークアッセイは、ウイルスサンプル内のプラーク形成単位（PFU）の数を決定します。これは、ウイルス量の1つの尺度です。このアッセイは、ペトリ皿またはマルチウェル細胞培養プレートで行われる微生物学的方法に基づいています。具体的には、さまざまな希釈度のウイルスを含むサンプルを適用して宿主 細胞の合流した単層に感染させ、次に寒天やカルボキシメチルセルロースなどの半固体培地で覆い、液体培地で起こるようなウイルス感染が無差別に広がるのを防ぎます。ウイルスが固定された細胞単層内の細胞に感染すると、ウイルスプラークが形成されます。 ^[2] ウイルスに感染した細胞は溶解して隣接する細胞に感染を広げ、感染から溶解へのサイクルが繰り返されます。これにより、感染して溶解した細胞（ウイルスプラーク）の領域が、感染していない無傷の細胞に囲まれた領域になります。プラークは光学顕微鏡で観察するか、細胞染色技術（例えば、クリスタルバイオレット溶液で染色して無傷の細胞と溶解した細胞を視覚化する）を使用して視覚的に観察することができます。 ^[3] 分析するウイルスに応じて、プラークの形成には3〜14日かかります。プラークは通常手動でカウントされ、プラーク数と感染溶液（最初に細胞に塗布されたサンプル）の希釈係数を組み合わせて、サンプル単位体積あたりのプラーク形成単位の数（PFU / mL）を計算します。PFU / mLの数値は、サンプル内の感染性ウイルス粒子の濃度を表し、形成された各プラークが1つの感染性ウイルス粒子による初期感染を表すという仮定に基づいています。^{[4] [5]}

フォーカス形成アッセイ (FFA) はプラークアッセイの一種ですが、プラーク形成を検出するために細胞溶解に頼るのではなく、ウイルス抗原に特異的な蛍光標識抗体を使用した免疫染色技術を使用して、実際のプラークが形成される前に感染した宿主細胞と感染性ウイルス粒子を検出します。FFA は、細胞膜を溶解しないウイルスのクラスを定量化するのに特に役立ちます。これらのウイルスはプラークアッセイに適さないためです。プラークアッセイと同様に、宿主細胞単層をウイルスサンプルのさまざまな希釈度で感染させ、感染性ウイルスの拡散を制限する半固体オーバーレイ培地の下で比較的短いインキュベーション期間 (例: 24～72 時間) インキュベートして、感染細胞の局所的なクラスター (フォーカス) を作成します。次に、プレートをウイルス抗原に対する蛍光標識抗体でプローブし、蛍光顕微鏡を使用してフォーカスの数を数え、定量化します。 FFA法は、通常、プラークアッセイや50％組織培養感染量（TCID ₅₀）アッセイ（下記参照）よりも短時間で結果が得られますが、必要な試薬や機器の点でより高価になる可能性があります。アッセイの完了時間は、ユーザーがカウントしている領域のサイズにも依存します。領域が大きいほど時間がかかりますが、サンプルをより正確に表すことができます。FFAの結果は、1ミリリットルあたりのフォーカス形成単位、またはFFU/mLで表されます。^[6]

TCID ₅₀ (50% 組織培養感染量) アッセイは、感染性ウイルス力価の尺度です。このエンドポイント希釈アッセイは、感染した宿主の 50% を殺すために必要なウイルスの量、または接種した組織培養細胞の 50% に細胞変性効果を生み出すために必要なウイルスの量を定量化します。このアッセイは、ウイルスの致死量を決定しなければならない臨床研究アプリケーション、またはウイルスがプラークを形成しない場合に、より一般的に使用される可能性があります。^[要出典]組織培養のコンテキストで使用する場合、宿主細胞をプレートに播種し、ウイルスの連続希釈液を追加します。インキュベーション後、細胞死 (つまり、感染細胞) の割合を手動で観察して各ウイルス希釈液について記録し、その結果を使用して TCID _{50 の}結果を数学的に計算します。^{[6] [7]}アッセイ方法と原理に明確な違いがあるため、TCID ₅₀と pfu/mL またはその他の感染性アッセイの結果は同等ではありません。この方法は、細胞感染時間のため最大 1 週間かかる場合があります。^[8]

_{TCID 50}を計算するために一般的に使用される 2 つの方法( EC50、IC50、LD50などの他の種類の 50% エンドポイントを計算するためにも使用できます) は次のとおりです。

• スピアマン・カーバー^[9]
• リード・ミュンヒ法

TCID _{50と PFU の}理論的な関係は、ポアソン分布^[10]に基づいておよそ 0.69 PFU = 1 TCID _{50です。ポアソン分布とは、一定の空間 (ウェル内のウイルス培地の量) 内で、既知の平均速度 (ウイルス力価) で発生するランダム イベント (ウイルス粒子) の数を表す}確率分布です。ただし、実際には、2 種類のアッセイの設定が異なり、ウイルスの感染性は細胞齢、オーバーレイ培地などのさまざまな要因に非常に敏感であるため、同じウイルス + 細胞の組み合わせであってもこの関係が成立しない可能性があることを強調する必要があります。ただし、次の参考文献では、この関係を別の方法で定義しています。

ATTCより：「同じ細胞システムが使用され、ウイルスがそれらの細胞上にプラークを形成し、プラーク形成を阻害する手順が追加されないと仮定すると、1 mL のウイルス ストックには TCID 50 の約半分のプラーク形成単位 (PFU) があると予想されます_。これは推定値に過ぎませんが、感染した細胞層の 50% に感染する限界希釈度では、感染した細胞層に最初に 1 つのプラークが生成されることが予想されるという理論に基づいています。場合によっては、2 つ以上のプラークが偶然形成される可能性があるため、実際の PFU 数は実験的に決定する必要があります。」

_{「数学的には、TCID 50}の陰性チューブはプラーク形成単位がゼロであることを表し、陽性チューブはそれぞれ1つ以上のプラーク形成単位を表すため、予想される PFU は TCID _{50 の}半分よりいくらか大きくなります。より正確な推定値は、ポアソン分布を適用すると得られます。ここで、 ⁠ ⁠は陰性チューブの割合、m は体積あたりの感染単位の平均数 (PFU/ml)、⁠ ⁠です。TCID ₅₀として表される任意の力価について、⁠ ⁠ です。したがって⁠ ⁠および⁠ ⁠は約 0.7 です。 ${\displaystyle P(o)}$${\displaystyle P(o)=\exp(-m)}$${\displaystyle P(o)=0.5}$${\displaystyle \exp(-m)=0.5}$${\displaystyle m=-\ln 0.5}$

したがって、TCID _{50力価 (ml あたり) に 0.7 を掛けて、PFU/ml の平均数を予測することができます。実際にこのような計算を適用する場合、計算された平均値は、プラークを視覚化するために必要なプロトコルの変更によって、TCID 50}に使用される条件下での発現と比較して感染性ウイルスの発現が変化しない場合にのみ有効になることに注意してください。

「したがって、作業推定値として、TCID ₅₀が1×10 ⁵ TCID _{50 /mLの物質は0.7×10} ⁵ PFUs/mLを生成すると想定できます。」 ^[11]

タンパク質および抗体ベースのウイルス定量アッセイには、いくつかのバリエーションがあります。一般に、これらの方法では、感染した細胞やウイルス粒子の数ではなく、サンプル内のすべてのタンパク質の量または特定のウイルスタンパク質の量を定量します。定量は一般的に比色または蛍光検出に依存します。アッセイの中には、サンプル中のタンパク質を直接定量するものもあれば、定量前に宿主細胞に感染させてインキュベートし、ウイルスを増殖させるものもあります。使用するバリエーションは、主に初期サンプル中のタンパク質（つまり、ウイルスタンパク質）の量とアッセイ自体の感度によって異なります。インキュベーションとウイルスの増殖が必要な場合は、分析前に細胞および/またはウイルスの溶解/消化を行うことがよくあります。ほとんどのタンパク質ベースの方法は比較的迅速かつ感度が高いですが^{[要出典]、}正確な較正には品質基準が必要であり、実際のウイルス粒子濃度ではなくタンパク質を定量します。以下は、広く使用されているタンパク質ベースのアッセイの具体的な例です。

ヘマグルチニンアッセイ（HA）は、インフルエンザに特有の一般的な非蛍光タンパク質定量アッセイです。これは、インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニンが赤血球を凝集させる（つまり、赤血球を一緒に凝集させる）という事実に基づいています。このアッセイでは、インフルエンザサンプルの希釈液を1％赤血球溶液で1時間インキュベートし、凝集が最初に起こるウイルス希釈度を視覚的に決定します。このアッセイでは、ヘマグルチニン単位（HAU）の結果が生成され、典型的なPFU対HAU比は10 ^6の範囲です。^{[12] [13] [14]} このアッセイは完了するまでに約1～2時間かかります。

血球凝集抑制試験は、血清中のインフルエンザ特異的抗体レベルを測定するために使用されるHA試験の一般的なバリエーションです。このバリエーションでは、インフルエンザウイルスに対する血清抗体が赤血球へのウイルスの付着を妨害します。したがって、抗体が十分な濃度で存在すると、血球凝集は阻害されます。^[15]

ビシンコニニク酸アッセイ（BCA、別名スミスアッセイ）は、単純な比色測定に基づいており、一般的に使用されているタンパク質定量アッセイです。^{[16] BCAは、}ローリーまたはブラッドフォードタンパク質アッセイに似ています。BCAアッセイ試薬は、ピアスケミカルカンパニー（現在はサーモフィッシャーサイエンティフィックが所有）によって最初に開発され、商業的に製造され、2006年まで特許を保持していました。^{[17] [18]}

BCAアッセイでは、タンパク質のペプチド結合が定量的にCu ^2+をCu ¹⁺に還元し、明るい青色を生成します。BCAはCu ^1+を2：1の比率でキレート化し、 562 nmで吸収するより濃い色の種を生成します。562 nmでのサンプルの吸光度を使用して、サンプル中のバルクタンパク質濃度を決定します。アッセイ結果は、分光光度計またはプレートリーダーで分析した後、既知の標準曲線と比較されます。^[19] 総アッセイ時間は30分から1時間です。このアッセイは遍在的で高速ですが、サンプル内のすべてのタンパク質をカウントするため、ウイルスタンパク質に対する特異性がありません。したがって、定量するウイルス調製物には、非常に低レベルの宿主細胞タンパク質が含まれている必要があります。

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、抗原特異的抗体を酵素に化学的に結合させて（または酵素に結合した二次抗体に結合させて）抗体ベースの測定法であり、サンプル中の未知の量の抗原（例：ウイルスタンパク質）の存在を検出する。抗体と抗原の結合イベントは、基質試薬を変換して検出可能な信号を生成する酵素の能力を通じて検出および/または定量化され、その後、サンプル中の標的抗原の濃度を計算するために使用できる。^[20] ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）は、信号を増幅し、測定感度を高める能力があるため、ELISAスキームでよく使用される酵素である。

ELISAアッセイには多くのバリエーションや種類がありますが、一般的には間接法、競合法、サンドイッチ法、逆法に分類されます。^[21]

マンチーニ法としても知られるシングルラジアル免疫拡散アッセイ（SRID）は、半固体培地（寒天など）での免疫拡散によって特定のウイルス抗原の量を検出するタンパク質アッセイです。培地には目的の抗原に特異的な抗血清が含まれており、抗原はディスクの中央に配置されます。抗原が培地に拡散すると、沈殿リングが形成され、平衡に達するまで成長します。アッセイ時間は、抗原と抗体の平衡時間に応じて10時間から数日間の範囲になります。リングからのゾーン直径は、タンパク質濃度の対数と直線的に関連しており、定量化のために既知のタンパク質標準のゾーン直径と比較されます。^[22]

定量PCRはポリメラーゼ連鎖反応化学を利用してウイルスDNAまたはRNAを増幅し、蛍光による検出と定量に十分な濃度を生成します。一般に、qPCRによる定量は、較正と参照のために未知のサンプルと並行して分析される既知濃度の標準の連続希釈に依存しています。定量検出は、配列特異的プローブやSYBR Greenなどの非特異的蛍光色素など、さまざまな蛍光検出戦略を使用して達成できます。^[23] TaqMan Molecular BeaconsやScorpion などの配列特異的プローブは、 反応中に生成された適切な配列のDNAにのみ結合します。SYBR Green色素は、反応中に生成されたすべての二本鎖DNAに結合します^[24]。

SYBR Greenは使いやすいが、特異性に欠け、感度が低いため、ほとんどの研究室ではプローブベースのqPCR検出スキームを使用している。^[要出典] qPCRには比較閾値法など多くのバリエーションがあり、内部標準を含む複数のサンプルからのCt値（生成物の統計的に有意な増加を示すPCRサイクル）を比較することで相対的な定量化を可能にする。^[25]

PCR は、完全な感染性ウイルス粒子に由来するもの、欠陥のあるウイルス粒子に由来するもの、および溶液中の遊離核酸を含むすべての標的核酸を増幅します。このため、qPCR の結果 (ゲノム コピー数/mL で表される) は、TEM の結果よりも量が多くなる可能性があります。ウイルスの定量では、全ウイルス粒子と核酸のコピーの比率が 1 対 1 になることはほとんどありません。これは、ウイルスの複製中に、核酸とウイルス タンパク質が常に 1:1 の比率で生成されるとは限らず、ウイルスの組み立てプロセスによって完全なウイルス粒子と空のカプシドおよび/または過剰な遊離ウイルス ゲノムが生成されるためです。口蹄疫ウイルスの例では、活発に複製している宿主細胞内の全ウイルス粒子と RNA コピーの比率は約 1:1000 です。^[26] qPCR による滴定の利点には、ターンアラウンド タイムが短い (1～4 時間) ことと感度が高い (他の方法よりもはるかに低濃度のウイルスを検出できる) ことが挙げられます。

可変抵抗パルスセンシング（TRPS）は、サイズ調整可能なナノポアにウイルス粒子を1つずつ通すことで、個々のウイルス粒子の高スループット単一粒子測定を可能にする方法です。 ^[27]この技術の利点は、溶液中のウイルス粒子のサイズと濃度を高解像度で同時に測定できることです。これは、サンプルの安定性と凝集体の寄与、および総ウイルス粒子濃度（vp/mL）を評価するために使用できます。^[28]

TRPS ベースの測定はイオン緩衝液中で行われ、分析前にサンプルを前染色する必要がないため、蛍光染料で前処理する必要がある技術よりも迅速で、準備と測定の合計時間はサンプルあたり 10 分未満です。^[要出典] TRPS ベースのウイルス分析は、測定後にオートクレーブで化学的に除染できる qViro-X システム を通じて市販されています。

この技術は、DegueldreとFavarger（2003）[29]によって発見され、後に他のナノ粒子（例：金コロイド、Degueldreら（2006）を参照）に適応された単一粒子誘導結合プラズマ質量分析法（^SP ICP-MS）に似ています。^[30] SP ICP-MSは、包括的な研究、すなわちDegueldre（2021）で単一ウイルス誘導結合プラズマ質量分析法（SV ICPMS）の分析に適応されました。^[31]この研究では、この方法を単一ウイルス（SV）の識別と計数に適応することを提案しています。SV検出モードでの高解像度マルチチャンネルセクターフィールド（MC SF）ICP-MSレコードにより、マスターイオンとキーイオンを計数することで、単一ウイルスの分析と識別が可能になります。2〜500個のウイルス単位の計数は20秒で実行できます。マスターイオン12C+、13C+、14N+、15N+ およびキーイオン 31P+、32S+、33S+、34S+の分析は、Ar トーチで行うことが提案されています。すべての干渉について詳細に説明します。高解像度の MC ICP-MS の使用が推奨されますが、四重極 ICP-MS を使用する場合は、分析をアップグレードするために嫌気性/好気性雰囲気のオプションが検討されます。2 種類のウイルス (SARS-COV2 およびバクテリオファージ T5) への適用は、選択されたウイルスイオンの時間スキャンおよび固定質量分析を使用して調査され、N/C、P/C、および S/C モル比を使用して種の特性評価を行い、それらの数濃度を定量化できます。

ほとんどのフローサイトメーターは感度が十分ではありませんが^{[引用が必要]} 、ウイルスの定量に使用できる市販のフローサイトメーターがいくつかあります。ウイルスカウンターは、共局在するタンパク質と核酸を検出するために蛍光を使用して、サンプル内の完全なウイルス粒子の数を定量します。サンプルは、タンパク質に特異的な染料と核酸に特異的な染料の2つで染色され、レーザービームを通過するときに分析されます。2つの異なる蛍光チャネルのそれぞれで同時イベントを生成する粒子の量は、測定されたサンプルの流量とともに決定され、ウイルス粒子の濃度 (vp/mL) を計算します。^[32] 結果は、絶対量では一般にTEMの結果に似ています。このアッセイの線形動作範囲は10 ⁵ –10 ⁹ vp/mLで、分析時間は約10分で、サンプルの準備時間は短いです。^{[引用が必要]}

TEMは特殊なタイプの顕微鏡で、磁場で焦点を絞った電子ビームを使用してサンプルを画像化します。TEM は、光学顕微鏡の 1000 倍の空間分解能 (解像度 0.2 nm まで) で画像化できます。^[33] 極薄のネガティブ染色サンプルが必要です。サンプルの準備には、コーティングされた TEM グリッド上に標本を配置し、電子不透過性液体でネガティブ染色することが含まれます。^[34] 組織に埋め込まれたサンプルも、薄く切片化すれば検査できます。サンプルの準備はプロトコルとユーザーによって異なりますが、通常は完了するまでに数時間かかります。TEM 画像では個々のウイルス粒子を表示でき、定量的な画像分析を使用してウイルス濃度を判断できます。これらの高解像度の画像は、他のほとんどの方法では不可能な粒子の形態情報も提供します。定量的な TEM 結果は、感染性に関係なくすべての粒子が報告された mL あたりのウイルス様粒子 (vlp/mL) の結果で定量化されるため、他のアッセイの結果よりも大きくなることがよくあります^[要出典]。定量的 TEM は、通常、ウイルス濃度が 10 ⁶粒子/mLを超える場合に有効です。機器のコストが高く、必要なスペースとサポート設備が多いため、TEM 装置は少数の研究室でしか利用できません。

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