抑制装置

リプレッシレーターは、少なくとも3つの遺伝子を持つ少なくとも1つのフィードバックループで構成される遺伝子制御ネットワークであり、各遺伝子はループ内の次の遺伝子を抑制するタンパク質を発現します。^[1]生物学研究では、リプレッシレーターは細胞モデルの構築と細胞機能の理解に使用されています。人工のリプレッシレーターと天然のリプレッシレーターの両方があります。最近、シロイヌナズナ（A. thaliana）と哺乳類システムにおける天然のリプレッシレーター時計遺伝子回路が研究されています。

人工的な抑圧装置

人工リプレッサーは、2000年にマイケル・エロウィッツとスタニスラス・ライブラーによって初めて設計され、^[2]細胞成分と機能の単純なシステムを研究する他の研究プロジェクトを補完しました。細胞の機能を付与する設計と細胞メカニズムを理解しモデル化するために、エロウィッツとライブラーは、3つの転写リプレッサーを含むループで構成される人工ネットワークを作成しました。このネットワークは、一定期間の電気発振器システムのように機能する安定した振動を示すようにゼロから設計されました。このネットワークは、組み換えDNAの導入により大腸菌（E. coli）に実装されました。その後、設計されたコロニーが実際に目的の振動動作を示すことが検証されました。

リプレッシレーターはフィードバックループで接続された3つの遺伝子で構成され、各遺伝子はループ内の次の遺伝子を抑制し、前の遺伝子によって抑制されます。大腸菌への合成挿入では、緑色蛍光タンパク質（GFP）がレポーターとして使用されたため、ネットワークの動作は蛍光顕微鏡を使用して観察できました。

遺伝子によって翻訳された各タンパク質がサイクル内の次のタンパク質を抑制する、リプレッサー遺伝子制御ネットワーク。

リプレッシャの設計は、離散的および確率論的解析モデルを用いた生物学的および回路的原理に基づいて行われた。タンパク質およびmRNA濃度、ならびに適切なパラメータおよびヒル係数値に基づいて、6つの微分方程式を使用してリプレッシャシステムの動態をモデル化した。この研究では、ElowitzとLeiblerは、積分値および一般的なパラメータ値、ならびに同様のパラメータを使用したリプレッシャモデルの確率論的バージョンを使用して、リプレッサータンパク質の振動を示す図を作成した。これらのモデルを分析して、持続的な振動を生み出すさまざまな速度の値を決定した。これらの振動は、効率的なリボソーム結合部位に結合されたプロモーター、協調的な転写リプレッサー、および同等のタンパク質およびmRNAの減衰速度によって促進されることが判明した。

この分析により、遺伝子に組み込まれた 2 つの設計上の特徴が生まれました。まず、プロモーター領域が、大腸菌ファージ ラムダPL (λ PL) プロモーターとlac リプレッサー( Lacl ) およびTet リプレッサー( TetR ) オペレーター配列を組み合わせた、より効率的なハイブリッドプロモーターに置き換えられました。次に、リプレッサータンパク質と mRNA の寿命の差を減らすために、 ssrA-RNA 配列に基づくカルボキシ末端タグが各リプレッサー遺伝子の 3' 末端に追加されました。このタグは、タンパク質を分解する標的となるプロテアーゼによって認識されます。この設計は、リプレッサーをコードする低コピープラスミドと高コピーレポーターを使用して実装され、これらを使用して大腸菌の培養物を形質転換しました。

天然の抑制因子

植物

植物の概日回路は、リプレッシャレーターと呼ばれる転写制御フィードバックループを特徴としています。A. thalianaのコア発振器ループ（灰色で囲まれている）では、まず2つのクリプトクロムと5つのフィトクロムによって光が感知されます。 2つの転写因子、Circadian Clock Associated 1 (CCA1) とLate Elongated Hypocotyl (LHY) は、Timing of CAB expression 1 ( TOC1 ) などの夕方の発現に関連する遺伝子を抑制し、朝の発現に関連する遺伝子のプロモーターに結合して活性化します。夕方の遺伝子であるTOC1 は、未知のメカニズムを介してCCA1とLHY を正に制御します。^{[3]夕方に位相が合う転写因子 CCA1 Hiking Expedition (CHE) とヒストン脱メチル化酵素 jumonji C ドメイン含有 5 (JMJD5) は}CCA1 を直接抑制します。他の成分は一日を通して発現し、概日リズム回路の連続要素を直接的または間接的に阻害または活性化し、それによって複雑で堅牢かつ柔軟なフィードバックループのネットワークを形成することがわかっています。^[3]

朝顔の表情

朝相発現ループとは、 A. thalianaの日中のリズムを制御する遺伝子とタンパク質を指します。2つの主な遺伝子はLHYとCCA1で、LHYおよびCCA1転写因子をコードしています。^[4]これらのタンパク質はヘテロ二量体を形成し、核内に入りTOC1遺伝子プロモーターに結合してTOC1タンパク質の生成を抑制します。TOC1タンパク質が発現すると、転写を阻害することでLHYとCCA1を制御する働きをします。これは後に2012年にAlexandra Pokhilo博士によって裏付けられ、彼女は計算分析を使用してTOC1がLHYおよびCCA1発現の阻害剤としてこの役割を果たしていることを示しました。 ^[5]朝相ループは胚軸の伸長を促進する夕方相ループとは対照的に、胚軸の伸長を阻害する働きをします。朝の位相ループは、夕方の位相発現遺伝子が変異すると概日リズムをサポートできなくなることが示されており、^[5]この自然発生的な抑制因子の各コンポーネントの相互依存性を示唆しています。

夕方の表情

早期開花3 ( ELF3 )、早期開花4 ( ELF4 )、およびPhytoclock1 ( LUX )は、A. thalianaにおける夕方位相の時計遺伝子発現の鍵となる要素である。これらは夕方複合体を形成し、その中でLUXはフィトクロム相互作用因子4 ( PIF4 )およびフィトクロム相互作用因子5 ( PIF5 )のプロモーターに結合し、それらを阻害する。 ^[3]その結果、夕方早い時間に胚軸の伸長が抑制される。夜遅くに阻害が緩和されると、胚軸は伸長する。光周期開花は出力遺伝子Gigantea ( GI )によって制御される。GIは夜に活性化され、 Constans ( CO )の発現を活性化し、これがFlowering Locus T ( FT )の発現を活性化する。そしてFTは長日開花を引き起こす。^[3]

哺乳類

哺乳類は、生理機能と行動の両方を24時間周期に調整するための内因性タイミング機構を発達させました。^[6] 2016年に研究者らはこの機構内の3つの連続した抑制シーケンスをリプレッシャとして特定し、現在ではこの概日リズムネットワークの主要な中核要素として機能していると考えられています。このシステムの必要性は、クリプトクロム（Cry）、周期（Per）、およびRev-erb の一連の遺伝子ノックアウトを通じて確立されました。これらは、ノックアウトすると不整脈を引き起こす中核哺乳類時計遺伝子です。 ^[6]これらの研究者らが作成したモデルには、Eボックスを介した転写のドライバーとしてBmal1 、それぞれ初期および後期EボックスリプレッサーとしてPer2とCry1、およびDボックス調節因子Dbpと核受容体Rev-erb-αが含まれています。Rev-erb、Per、Cry1による連続的な抑制は持続的な振動を生み出すことができ、この抑制因子以外の他のすべての成分をクランプすることで、同様の振幅と周期で振動が持続します。^[6]研究者によって公開されたさまざまな図で示されているように、すべての振動ネットワークはこれら3つのコア遺伝子の任意の組み合わせに関与しているようです。

意義

合成生物学

人工抑制因子は、大腸菌に合成阻害ループを移植することによって発見されました。これは、生物に合成振動を初めて実装したことを意味します。さらに、モデル生物で合成的に振動の変異した成分を救済できる可能性も示唆されています。^[7]

人工リプレッシャは、遺伝子制御ネットワークを設計し、実装して新しい機能を実行できることを示した合成生物学の画期的な出来事です。しかし、細胞の振動は一定期間後に位相がずれ、人工リプレッシャの活動は細胞の成長に影響されることがわかりました。そのため、最初の実験^{[7]により、多くの生物に見られる}概日時計が新たな評価を得ることになりました。内因性リプレッシャは、埋め込まれた人工リプレッシャよりもはるかに堅牢だからです。理化学研究所定量生命システム研究センターの新しい調査では、単一のタンパク質分子に化学修飾を加えることで、温度に依存しない自立型発振器を形成できることがわかりました。^[12]

人工抑制因子は、概日生物学から内分泌学まで幅広い分野の研究や治療に役立つ可能性があります。人工抑制因子は、自然の生物学的システムに固有の同期とそれに影響を与える要因を実証できる可能性が高まっています。^[13]

概日生物学

A. thalianaのような内因性の概日リズムを持つモデル生物における天然の抑制因子の理解を深めることは、特に植物の育成や家畜の管理に関して、農業への応用が期待されます。^[14]

参考文献

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外部リンク

リプレッシレーターモデルへの直接リンクとBioModelsデータベースの説明
R でのリプレッシレーターのシミュレーション: https://gist.github.com/AndreyAkinshin/37f3e68a1576f9ea1e5c01f2fd64fe5e
リプレッシレーターのオンラインシミュレーション: https://www.yschaerli.com/repressilator.html
A. thalianaのフィードバックループシステムの図
CCA1 遺伝子とそれがA. thalianaで果たす役割に関する情報への直接リンク

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