ウイルス定量

プラークアッセイは、感染量の観点からウイルス濃度を決定するためによく用いられる方法です。プラークアッセイは、ウイルスサンプル中のプラーク形成単位（PFU）の数を測定し、これはウイルス量の指標の一つです。このアッセイは、ペトリ皿またはマルチウェル細胞培養プレートで行われる微生物学的方法に基づいています。具体的には、コンフルエントな単層培養細胞に、様々な希釈濃度のウイルスを含むサンプルを塗布して感染させ、その後、液体培地で起こるような無差別なウイルス感染の拡散を防ぐために、寒天やカルボキシメチルセルロースなどの半固体培地で覆います。固定された単層培養細胞内でウイルスが細胞に感染すると、ウイルスプラークが形成されます。 ^{[ 2 ]} ウイルスに感染した細胞は溶解し、隣接する細胞に感染を広げ、そこで感染から溶解までのサイクルが繰り返されます。これにより、感染して溶解した細胞（ウイルスプラーク）の領域が、感染していない無傷の細胞に囲まれて形成されます。プラークは光学顕微鏡で観察するか、細胞染色法（例えば、無傷の細胞と溶解した細胞を可視化するためにクリスタルバイオレット溶液で染色する）を用いて目視で観察することができる。 ^{[ 3 ]} プラーク形成には、分析対象のウイルスによって3～14日かかることがある。プラークは通常手動でカウントされ、プラーク数と感染溶液（細胞に最初に適用されたサンプル）の希釈係数を組み合わせて、サンプル単位体積あたりのプラーク形成単位数（PFU/mL）を計算する。PFU/mLの値はサンプル中の感染性ウイルス粒子の濃度を表し、形成された各プラークが1つの感染性ウイルス粒子による初期感染を表しているという仮定に基づいている。^{[ 4 ] [ 5 ]}

フォーカス形成アッセイ（FFA）はプラークアッセイの一種ですが、プラーク形成を検出するために細胞溶解に依存するのではなく、FFAはウイルス抗原に特異的な蛍光標識抗体を用いた免疫染色技術を用いて、実際のプラークが形成される前に感染した宿主細胞と感染性ウイルス粒子を検出します。FFAは、細胞膜を溶解しないウイルスの定量に特に有用です。これらのウイルスはプラークアッセイには適さないためです。プラークアッセイと同様に、宿主細胞単層に様々な希釈濃度のウイルスサンプルを感染させ、感染性ウイルスの拡散を制限する半固体オーバーレイ培地の下で比較的短い培養期間（例えば24～72時間）インキュベートし、感染細胞の局所的なクラスター（フォーカス）を形成させます。その後、プレートをウイルス抗原に対する蛍光標識抗体でプローブし、蛍光顕微鏡を用いてフォーカスの数をカウントおよび定量します。 FFA法は通常、プラークアッセイや50%組織培養感染量（ _TCID50 ）アッセイ（下記参照）よりも短時間で結果が得られますが、必要な試薬や機器の点でより高価になる場合があります。アッセイの完了時間は、ユーザーがカウントする領域の大きさにも依存します。領域が大きいほど時間がかかりますが、サンプルのより正確な表現が得られます。FFAの結果は、1ミリリットルあたりのフォーカス形成単位（FFU/mL）で表されます。^{[ 6 ]}

TCID _{50 (50%組織培養感染量) アッセイは、感染性ウイルス}力価の測定法です。このエンドポイント希釈アッセイは、感染した宿主の 50% に感染させる、または接種した組織培養サンプルの 50% に細胞変性効果を生じさせるのに必要なウイルスの量を定量化します。このアッセイは、ウイルスの致死量を決定する必要がある臨床研究アプリケーションや、ウイルスがプラークを形成しない場合によく使用されます。組織培養のコンテキストで使用する場合、宿主細胞をプレートに播種し、ウイルスの連続希釈液を添加します。インキュベーション後、各ウイルス希釈液について細胞死 (すなわち感染細胞) の割合を手動で観察して記録し、その結果を使用して数学的に TCID ₅₀結果を計算します。^{[ 6 ] [ 7 ]}アッセイ方法と原理に明確な違いがあるため、TCID ₅₀と pfu/mL またはその他の感染性アッセイの結果は同等ではありません。この方法は、細胞感染時間のため、最大 1 週間かかる場合があります。^{[ 8 ]}

_TCID50を計算するために一般的に使用される2つの方法（ EC50、_IC50、LD50などの他のタイプの50%エンドポイントを計算するためにも使用できます）は次のとおり_です。

• スピアマン・カーバー^{[ 9 ]}
• リード・ミュンヒ法

TCID _{50と PFU の}理論的な関係は、ポアソン分布に基づくと約 0.69 PFU = 1 TCID _50です^{[ 10 ]。}ポアソン分布は、既知の平均速度 (ウイルス力価) で発生するランダムなイベント (ウイルス粒子) が、固定された空間 (ウェル内のウイルス培地の量) で発生する可能性が高い確率分布です。ただし、実際には、この関係は同じウイルス + 細胞の組み合わせであっても成り立たない可能性があることを強調する必要があります。これは、2 種類のアッセイの設定が異なり、ウイルスの感染性が細胞の年齢、オーバーレイ培地などのさまざまな要因に非常に敏感であるためです。ただし、次の文献では、この関係を異なる方法で定義しています。

ATCCより：「同じ細胞系を使用し、ウイルスがそれらの細胞上にプラークを形成し、プラーク形成を阻害するような手順が追加されていないと仮定すると、1 mLのウイルスストックには、TCID ₅₀の約半分のプラーク形成単位（PFU）が含まれると予想されます。これはあくまで推定値ですが、チャレンジされた細胞層の50%に感染する限界希釈では、感染した細胞層に最初に単一のプラークが形成されることが多いという根拠に基づいています。場合によっては、偶然に2つ以上のプラークが形成される可能性があり、したがって実際のPFU数は実験的に決定する必要があります。」

_{数学的には、予想されるPFUはTCID50}の半分よりやや大きくなる。なぜなら、 _TCID50の陰性チューブはプラーク形成単位がゼロであることを示し、陽性チューブはそれぞれ1つ以上のプラーク形成単位を示すからである。より正確な推定値はポアソン分布を適用することで得られる。ここで、${\displaystyle P(o)}$は陰性チューブの割合、mは体積あたりの感染単位数（PFU/ml）の平均値である。${\displaystyle P(o)=\exp(-m)}$⁠ _{。TCID 50}として表される力価については、${\displaystyle P(o)=0.5}$したがって​​${\displaystyle \exp(-m)=0.5}$そして​​${\displaystyle m=-\ln 0.5}$つまり約0.7です。

したがって、TCID ₅₀力価（1 mlあたり）に0.7を掛けることで、平均PFU/ml数を予測できます。実際にこのような計算を行う際には、プラークを可視化するために必要なプロトコルの変更が、TCID ₅₀に用いられる条件下での発現と比較して感染性ウイルスの発現を変化させない場合にのみ、計算された平均値が有効であることを覚えておいてください。

_{「したがって、作業上の推定として、TCID 50}が1 × 10 ⁵ TCID ₅₀ /mLの材料は0.7 × 10 ⁵ PFU/mLを生成すると想定できる。」 ^{[ 11 ]}

赤血球凝集反応（HA）は、インフルエンザに特異的な一般的な非蛍光タンパク質定量アッセイです。これは、インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニンが赤血球を凝集させる（つまり、赤血球を凝集させる）という事実に基づいています。このアッセイでは、インフルエンザサンプルの希釈液を1%赤血球溶液と1時間インキュベートし、凝集が最初に起こるウイルスの希釈度を視覚的に決定します。このアッセイは、赤血球凝集単位（HAU）の結果を生成し、典型的なPFUとHAUの比率は10⁶の^範囲です。^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]} このアッセイの完了には約1～2時間かかります。

赤血球凝集抑制試験は、血清中のインフルエンザ特異的抗体レベルを測定するために使用されるHA試験の一般的な変法です。この変法では、インフルエンザウイルスに対する血清抗体が、ウイルスの赤血球への付着を妨害します。したがって、抗体が十分な濃度で存在すると、赤血球凝集が抑制されます。^{[ 15 ]}

ビシンコニン酸アッセイ（BCAアッセイ、別名スミスアッセイ）は、単純な比色測定に基づいており、一般的に使用されているタンパク質定量アッセイです。^{[ 16 ]}

BCAは、ローリー法やブラッドフォード法によるタンパク質定量法に似ています。BCAアッセイ試薬は、最初にピアースケミカル社（現在はサーモフィッシャーサイエンティフィック社が所有）によって開発され、商業的に製造されました。同社は2006年まで特許を保有していました。^{[ 17 ] [ 18 ]}

BCAアッセイでは、タンパク質のペプチド結合が定量的にCu ²⁺をCu ¹⁺に還元し、淡青色を呈します。BCAはCu ^1+を2:1の比率でキレートし、562 nmで吸収するより濃い色の種を生成します。562 nmでのサンプルの吸光度を使用して、サンプル中のバルクタンパク質濃度を決定します。アッセイ結果は、分光光度計またはプレートリーダーで分析した後、既知の標準曲線と比較されます。^{[ 19 ]} アッセイの総時間は30分から1時間です。このアッセイは広く普及しており迅速ですが、サンプル中のすべてのタンパク質をカウントするため、ウイルス性タンパク質に対する特異性がありません。したがって、定量するウイルス製剤は高度に精製され、宿主、血清、キャリア、またはその他のタンパク質が含まれていない必要があります。  

酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、抗原特異的抗体を酵素に化学的に結合させたもの（または酵素に結合した2番目の抗体に結合させたもの）を利用して、サンプル中の未知量の抗原（例えば、ウイルス性タンパク質）の存在を検出する抗体ベースのアッセイです。抗体と抗原の結合イベントは、酵素が基質試薬を変換して検出可能なシグナルを生成する能力によって検出および/または定量化され、その後、サンプル中の標的抗原の濃度を計算するために使用できます。^{[ 20 ]}西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、シグナルを増幅してアッセイの感度を高める能力があるため、ELISAスキームでよく使用される酵素です。

ELISAアッセイには多くのバリエーションや種類がありますが、一般的には間接法、競合法、サンドイッチ法、または逆法に分類できます。^{[ 21 ]}重要なことに、ELISAでは感染性ウイルスと不活性ウイルスを区別することはできません。したがって、ELISAはウイルス粒子/タンパク質を定量することはできますが、ウイルスの効力や感染性を測定することはできません。

マンチーニ法としても知られる単一放射状免疫拡散アッセイ（SRID）は、半固体培地（例えば寒天）中で免疫拡散により特定のウイルス抗原の量を検出するタンパク質アッセイです。培地には目的の抗原に特異的な抗血清が含まれており、抗原はディスクの中心に配置されます。抗原が培地に拡散すると、沈殿リングが形成され、平衡に達するまで成長します。アッセイ時間は、抗原と抗体の平衡時間に応じて10時間から数日まで変化します。リングのゾーン直径はタンパク質濃度の対数と直線的に関連しており、定量のために既知のタンパク質標準のゾーン直径と比較されます。^{[ 22 ]} ELISAアッセイは、必要な材料が少なく、実施/解釈が容易であるため、診断ツールとして免疫拡散アッセイにほぼ取って代わりました。

定量PCRは、ポリメラーゼ連鎖反応化学を利用してウイルスDNAまたはRNAを増幅し、蛍光による検出および定量に十分な高濃度を生成します。一般的に、qPCRによる定量は、既知濃度の標準の連続希釈を、校正および参照のために未知のサンプルと並行して分析することに依存しています。定量検出は、配列特異的プローブやSYBR Greenなどの非特異的蛍光色素を含む、さまざまな蛍光検出戦略を使用して達成できます。^{[ 23 ]} TaqMan分子ビーコンやScorpion などの配列特異的プローブは、反応中に生成された適切な配列のDNAにのみ結合します。SYBR Green色素は、反応中に生成された すべての二本鎖DNAに結合します^{[ 24 ] 。}

SYBR Greenは使いやすいものの、特異性が低く感度も低いため、ほとんどの検査室ではプローブベースのqPCR検出法を採用している。qPCR には多くのバリエーションがあり、その中には比較閾値法も含まれる。この方法では、内部標準を含む複数のサンプルから得られたCt値（産物の統計的に有意な増加を示すPCRサイクル）を比較することで相対定量が可能となる。^{[ 25 ]}

PCR は、完全な感染性ウイルス粒子由来のもの、欠陥のあるウイルス粒子由来のもの、および溶液中の遊離核酸を含む、すべての標的核酸を増幅します。このため、qPCR の結果 (ゲノムコピー数/mL で表される) は、TEM の結果よりも量が多くなる傾向があります。ウイルスの定量化では、完全なビリオンと核酸のコピー数の比率は 1 対 1 になることはほとんどありません。これは、ウイルスの複製中に、核酸とウイルス タンパク質が常に 1:1 の比率で生成されるわけではなく、ウイルスの組み立てプロセスによって、完全なビリオンと空のカプシド、および/または過剰な遊離ウイルス ゲノムが生成されるためです。口蹄疫ウイルスの例では、活発に複製している宿主細胞内の完全なビリオンと RNA コピー数の比率は約 1:1000 です。^{[ 26 ]} qPCR による滴定の利点には、迅速なターンアラウンド タイム (1～4 時間) と感度 (他の方法よりもはるかに低い濃度のウイルスを検出できます) があります。

可変抵抗パルスセンシング（TRPS）は、サイズ調整可能なナノポアをウイルス粒子が一度に1つずつ通過する際に、個々のウイルス粒子の高スループット単一粒子測定を可能にする方法です。 ^{[ 27 ]}この技術の利点は、溶液中のウイルス粒子のサイズと濃度を高解像度で同時に決定できることです。これは、サンプルの安定性や凝集体の寄与、および総ウイルス粒子濃度（vp/mL）の評価に使用できます。^{[ 28 ]}

TRPSベースの測定はイオン緩衝液中で行われ、分析前にサンプルを染色する必要がないため、蛍光色素による前処理を必要とする方法よりも迅速で、サンプル1つあたり準備と測定にかかる時間は10分未満です。TRPSベースのウイルス分析は、 qViro-Xシステム を通じて市販されており、測定後にオートクレーブ処理によって化学的に除染することが可能です。

この技術は、 DegueldreとFavarger（2003） ^{[ 29 ]}によって発見され、後に他のナノ粒子（例えば金コロイド、Degueldreら（2006）を参照）に適用された単一粒子誘導結合プラズマ質量分析法（SP ICP-MS）に類似しています。[ ^{30 ] SP ICP-MSは、包括的な研究、すなわちDegueldre（2021） [ 31 ]}において、単一ウイルス誘導結合プラズマ質量分析法（SV ICPMS）の分析に適用されました。この研究では、この方法を単一ウイルス（SV）の識別と計数に適用することを提案しています。SV検出モードでの高分解能マルチチャンネルセクターフィールド（MC SF）ICP-MS記録により、マスターイオンとキーイオンの計数により、単一ウイルスの分析と識別が可能になります。2～500ウイルス単位の計数は20秒で実行できます。マスターイオン12C+、13C+、14N+、15N+、キーイオン 31P+、32S+、33S+、34S+ については、Ar トーチで分析を行うことが提案されています。すべての干渉について詳細に議論されています。高分解能 MC ICP-MS の使用が推奨されており、四重極 ICP-MS を使用する場合は、分析を向上させるために嫌気性/好気性雰囲気のオプションが検討されています。選択されたウイルスイオンのタイムスキャンと固定質量分析を使用して、2 種類のウイルス (SARS-COV2 とバクテリオファージ T5) への適用が調査されており、N/C、P/C、S/C のモル比を使用して種を特徴付け、それらの数濃度を定量化することができます。

ほとんどのフローサイトメーターは十分な感度を備えていませんが、ウイルス定量に使用できる市販のフローサイトメーターがいくつかあります。ウイルスカウンターは、蛍光を使用して共局在するタンパク質と核酸を検出することにより、サンプル中の無傷のウイルス粒子の数を定量します。サンプルは、タンパク質に特異的な色素と核酸に特異的な色素の2種類で染色され、レーザービームを通過する際に分析されます。2つの異なる蛍光チャネルのそれぞれで同時にイベントを生成する粒子の量が、測定されたサンプル流量とともに決定され、ウイルス粒子の濃度（vp/mL）が計算されます。^{[ 32 ]結果は、絶対量に関しては、一般的にTEMの結果と類似しています。このアッセイは、10 5}～ 10 ⁹ vp/mL の線形作業範囲を持ち、分析時間は約10分で、サンプルの準備時間は短くなっています。

ポリオウイルスのネガティブ染色透過型電子顕微鏡像、スケールバー = 50 nm

新型H1N1ウイルス粒子の組織包埋切片

TEMは、磁場によって集束された電子ビームを利用して試料を画像化する特殊な顕微鏡法です。TEMは、光学顕微鏡よりも1000倍高い空間分解能（分解能は0.2  nmまで）で画像化できます。^{[ 33 ]} 超薄切片でネガティブ染色された試料が必要です。試料の準備には、コーティングされたTEMグリッド上に試料を載せ、電子不透過性の液体でネガティブ染色することが含まれます。^{[ 34 ]} 組織包埋試料も、薄切すれば検査できます。試料の準備はプロトコルとユーザーによって異なりますが、一般的に完了までに数時間かかります。TEM画像では個々のウイルス粒子を表示でき、定量的画像解析を使用してウイルス濃度を決定できます。これらの高解像度画像は、他のほとんどの方法では得られない粒子形態情報も提供します。定量的TEMの結果は、感染性に関係なくすべての粒子が1 mLあたりのウイルス様粒子（vlp/mL）の結果で定量化されるため、他のアッセイの結果よりも大きくなることがよくあります。定量透過型電子顕微鏡（TEM）は、一般的に1mLあたり^10⁶個以上のウイルス濃度に対して有効です。しかし、装置の価格が高額であること、また設置スペースや関連設備が多額に必要なため、TEM装置を備えている研究室はごく少数に限られています。