光音響顕微鏡

光音響顕微鏡法は、光音響効果に基づく画像化法であり、光音響トモグラフィーのサブセットです。光音響顕微鏡法は、組織における光吸収の結果として生じる局所的な温度上昇を利用します。ナノ秒パルスレーザービームを使用すると、組織は熱弾性膨張を起こし、その結果、高周波超音波トランスデューサーを使用して検出できる広帯域音波が放出されます。^[1]組織内の超音波散乱は光散乱よりも弱いため、光音響顕微鏡法は従来の顕微鏡法よりも深いところで高解像度の画像を実現できます。さらに、光音響顕微鏡法は、そのスケーラビリティにより、バイオメディカルイメージングの分野で特に有用です。光学焦点と音響焦点を調整することにより、目的の画像化深度に合わせて横方向の解像度を最適化できます。^[2]

光音響顕微鏡の目的は、局所的な圧力上昇を見つけることです。この圧力上昇を使用して、次の式に従って 吸収係数を計算できます。${\displaystyle p_{0}}$ ${\displaystyle \mu_{a}}$

${\displaystyle p_{0}=\Gamma \eta _{th}\mu _{a}F,}$

ここで、は熱に変換される光の割合、は局所的な光フルエンス（J/cm ²）、無次元のグリュナイゼンパラメータは次のように定義されます。 ${\displaystyle \eta_{th}}$${\displaystyle F}$ ${\displaystyle \ガンマ}$

${\displaystyle \Gamma ={\frac {\beta }{\kappa \rho C_{V}}},}$

ここで、は体積膨張係数（K ⁻¹）、は等温圧縮率（Pa ⁻¹）、は密度（kg/m ³）である。^[3]${\displaystyle \beta}$${\displaystyle \kappa}$${\displaystyle \rho}$

最初の圧力上昇に続いて、光音響波が媒体内を音速で伝播し、超音波トランスデューサーで検出できます。

光音響顕微鏡法の主な利点の 1 つは、画像再構成の単純さです。レーザーパルスが軸方向に組織を励起し、その結果生じる光音響波が超音波トランスデューサーによって検出されます。次に、トランスデューサーは機械的エネルギーを電圧信号に変換し、後処理のためにアナログ/デジタル コンバーターで読み取ることができます。各レーザーパルスの結果として、A ラインと呼ばれる 1 次元画像が形成されます。Aラインのヒルベルト変換により、深度エンコードされた情報が明らかになります。その後、2D ラスター スキャンによって生成された複数の A ラインを組み合わせることで、3D 光音響画像を形成できます。^[3]

超音波トランスデューサーの要素の遅延を変更することで、音響レンズを通過するのと同様に超音波を集中させることができます。この遅延と加算の方法により、各焦点で信号を検出できます。ただし、横方向の解像度は、極角で現れ、各要素の幅に依存するサイドローブの存在によって制限されます。^[4]

光音響顕微鏡法を含む光音響画像化法では、コントラストは光子励起に基づいており、したがって組織の光学特性によって決まります。電子が光子を吸収すると、より高いエネルギー状態に移動します。より低いエネルギーレベルに戻ると、電子は放射緩和または非放射緩和のいずれかを起こします。放射緩和中、電子は光子の形でエネルギーを放出します。一方、非放射緩和中の電子はエネルギーを熱として放出します。その後、熱によって圧力上昇が誘発され、光音響波として伝播します。ほぼすべての分子が非放射緩和可能であるため、光音響顕微鏡法は、広範囲の内因性および外因性の因子を画像化できる可能性があります。対照的に、放射緩和が可能な分子は少ないため、1光子顕微鏡法や2光子顕微鏡法などの蛍光顕微鏡法には制限があります。^[3]現在の光音響顕微鏡の研究では、血液飽和度から癌の増殖率まで、身体に関する機能情報を得るために内因性および外因性の造影剤の両方を利用しています。

体内に自然に発生する分子である内因性造影剤は、非侵襲的に画像化できるため、光音響顕微鏡検査に有用である。内因性造影剤は毒性がなく、検査対象の組織の特性に影響を与えない。特に、内因性吸収剤は吸収波長に基づいて分類することができる。^[2]

紫外線範囲（λ = 180〜400 nm）では、体内の主な吸収体はDNAとRNAです。紫外線光音響顕微鏡を使用することで、蛍光標識を使用せずに細胞核内のDNAとRNAを画像化できます。がんはDNA複製の失敗に関連しているため、紫外線光音響顕微鏡はがんの早期発見に使用できる可能性があります。^[5]

可視光吸収体（λ = 400〜700 nm）には、酸化ヘモグロビン、脱酸化ヘモグロビン、メラニン、シトクロムcが含まれます。可視光光音響顕微鏡は、酸化ヘモグロビンと脱酸化ヘモグロビンの吸収プロファイルの違いにより、ヘモグロビン濃度と酸素飽和度を決定するのに特に有用です。その後、リアルタイム分析を使用して、血流速度と酸素代謝率を決定できます。^[3]さらに、皮膚がん細胞にはメラニンが高濃度で含まれているため、光音響顕微鏡は悪性黒色腫の早期検出が可能です。

近赤外線吸収体（λ = 700～1400 nm）には、水、脂質、ブドウ糖が含まれます。血糖値の光音響測定は糖尿病の治療に使用できますが、血管内の脂質濃度の研究は動脈硬化の進行を監視するために重要です。^[2]この波長では、吸収率を低く抑えて、脱酸素ヘモグロビンとヘモグロビンの濃度を定量化して比較することは依然として可能です。^[6]

内因性造影剤は非侵襲性で使い方も簡単ですが、その固有の挙動と濃度によって制限されるため、光吸収が弱い場合は特定のプロセスをモニタリングすることが困難です。一方、外因性造影剤は、特定の対象分子に特異的に結合するように設計することができます。さらに、外因性造影剤の濃度を最適化して、より大きな信号を生成し、より高いコントラストを提供することもできます。選択的結合により、外因性造影剤は特定の対象分子をターゲットにしながら、結果として得られる画像を強化することができます。^[3]

ICG -PEGやエバンスブルーなどの有機染料は、血管系を強調するだけでなく、腫瘍の画像を改善するために使用されています。さらに、染料はサイズが小さいため（≤ 3 nm）、体外に簡単に濾過されます。^[2]

ナノ粒子は現在、化学的に不活性で腫瘍細胞を標的にする能力があることから研究されています。これらの特性により、癌の増殖を監視でき、術中に癌を取り除くことも可能になります。しかし、ナノ粒子が臨床研究に適しているかどうかを判断するには、短期的な毒性効果に関するさらなる研究が必要です。^[2]金ナノ粒子は、画像誘導医療の造影剤として有望であることが示されています。AuNPは、その強力で調整可能な光吸収のため、造影剤として広く使用されています。^[7]

蛍光タンパク質は蛍光顕微鏡画像化用に開発されており、遺伝子コード化できるため体内に投与する必要がないという点でユニークです。光音響顕微鏡を使用すると、一般的な顕微鏡法の限界を超える深さで蛍光タンパク質を視覚化できます。^[2]組織内の周波数依存の音響減衰と高周波数の減衰により、組織の深部を通る光伝播の帯域幅が制限されます。蛍光タンパク質は、光減衰の制限を回避して、ターゲット領域で光源として機能します。ただし、光拡散方程式では 5% 未満の増加が予測されるため、蛍光タンパク質の有効性は低いフルエンスの変化によって制限されます。^[8]

光音響顕微鏡は、超音波検出により従来の顕微鏡よりも優れた透過性を実現します。その結果、軸方向の解像度は音響的に定義され、次の式で決定されます。

${\displaystyle R_{axis}=0.88{\frac {\nu _{A}}{\Delta f_{A}}},}$

ここで、は媒体中の音速、は光音響信号の帯域幅です。帯域幅が光音響信号の帯域幅と一致する限り、より広い帯域幅の超音波トランスデューサーを使用することで、システムの軸方向の解像度を向上させることができます。光音響顕微鏡の横方向の解像度は、システムの光学焦点と音響焦点に依存します。光学解像度光音響顕微鏡 (OR-PAM) は音響焦点よりも狭い光学焦点を使用し、音響解像度光音響顕微鏡 (AR-PAM) は光学焦点よりも狭い音響焦点を使用します。^{[9] [10]}${\displaystyle \nu_{A}}$${\displaystyle \Delta f_{A}}$

OR-PAMは光学焦点がより狭いため、1mmまでの深さの準弾道範囲での画像化に適しています。^[9] OR-PAMの横方向解像度は次の式で決まります。

${\displaystyle R_{lateral,O}=0.51{\frac {\lambda _{O}}{NA_{O}}},}$

ここで、は光の波長、は光学対物レンズの開口数です。 ^[2] OR-PAMの横方向分解能は、より短いレーザーパルスとレーザースポットのより狭い焦点を使用することで向上できます。OR-PAMシステムは通常、0.2〜10μmの横方向分解能を達成できるため、OR-PAMは超解像イメージング法として分類できます。 ${\displaystyle \lambda _{O}}$${\displaystyle NA_{O}}$

1 mm より深く 3 mm までの深さでは、光散乱が大きくなるため、音響分解能光音響顕微鏡 (AR-PAM) の方が便利です。音響散乱は光拡散限界を超えるとはるかに弱くなるため、これらの深さではより高い横方向分解能が得られるため、AR-PAM の方が実用的です。AR-PAM の横方向分解能は、次の式で決まります。

${\displaystyle R_{lateral,A}=0.71{\frac {\lambda _{A}}{NA_{A}}},}$

ここで、は光音響波の中心波長であり、は超音波トランスデューサの開口数である。^[2]したがって、超音波トランスデューサの中心周波数を上げ、音響フォーカスを絞ることで、より高い横方向分解能を実現できる。AR-PAMシステムは通常、15～50μmの横方向分解能を実現できる。 ${\displaystyle \lambda _{A}}$${\displaystyle NA_{A}}$

暗視野共焦点光音響顕微鏡法は、弾道光を無視することで表面信号を低減します。この方法では、暗視野パルスレーザーと高 NA 超音波検出を使用し、ファイバー出力端を集束超音波トランスデューサーと同軸に配置します。弾道光のフィルタリングは、従来の暗視野顕微鏡法で使用される不透明ディスクではなく、励起レーザービームの形状変更に依存します。一般的な再構成技術を使用して光音響信号を 1 つの A ラインに変換し、B ライン画像はラスタースキャンによって生成されます。^[4]

光音響顕微鏡は、生物医学分野で幅広い用途があります。光音響顕微鏡は、光の波長に基づいてさまざまな分子を画像化できるため、非侵襲的に身体の機能情報を取得するために使用できます。血流のダイナミクスと酸素代謝率を測定し、アテローム性動脈硬化症や腫瘍の増殖の研究と相関させることができます。外因性因子を使用して癌組織に結合し、画像のコントラストを高め、外科的除去を補助することができます。同様に、光音響顕微鏡は、健康な組織と比較して光吸収特性が異なるため、癌の早期診断に役立ちます。^[1]

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• 光音響イメージングにおけるディープラーニング