ノーザンブロット

ノーザンブロット、またはRNAブロット^{[ 1 ]}は、サンプル中のRNA（または単離されたmRNA ）を検出することによって遺伝子発現を研究するために分子生物学研究で使用される技術です。 ^{[ 2 ] [ 3 ]}

ノーザンブロッティングでは、分化や形態形成中、および異常または疾患状態における特定の遺伝子発現率を決定することにより、構造と機能に対する細胞制御を観察することが可能です。 ^{[ 4 ]}ノーザンブロッティングでは、電気泳動 を使用してRNAサンプルをサイズで分離し、標的配列の一部または全体に相補的なハイブリダイゼーションプローブを使用して検出します。厳密に言えば、「ノーザンブロット」という用語は、電気泳動ゲルからブロッティング膜へのRNAの毛細管転写を具体的に指します。しかし、プロセス全体が一般的にノーザンブロッティングと呼ばれています。^{[ 5 ]}ノーザンブロット技術は、1977年にスタンフォード大学のJames Alwine、 David Kemp、およびGeorge Stark によって開発されました。^{[ 6 ]}ノーザンブロッティングという名前は、生物学者Edwin Southernにちなんで名付けられた最初のブロッティング技術であるサザンブロットとの類似性から付けられました。^{[ 2 ]} 主な違いは、ノーザンブロットではDNAではなくRNAが分析される点である。 ^{[ 7 ]}

一般的なブロッティング手順^{[ 5 ]}は、均質化した組織サンプルまたは細胞から総RNAを抽出することから始まります。次に、オリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーを使用してポリ(A)テールを持つRNAのみを分離することにより、真核生物mRNAを分離できます。^{[ 8 ] [ 9 ]} 次に、RNAサンプルをゲル電気泳動で分離します。ゲルは壊れやすく、プローブはマトリックスに入ることができないため、サイズによって分離されたRNAサンプルは、キャピラリーまたは真空ブロッティングシステムを介してナイロンメンブレンに転写されます。

正電荷を帯びたナイロン膜は、負電荷を帯びた核酸がそれらに対して高い親和性を持つため、ノーザンブロッティングに最も効果的です。ブロッティングに使用される転写バッファーには通常ホルムアミドが含まれています。これは、プローブとRNAの相互作用のアニーリング温度を下げ、RNAの分解を引き起こす可能性のある高温を不要にするためです。^{[ 10 ]} RNAが膜に転写されると、UV光または熱によって膜に共有結合で固定されます。プローブが標識された後、膜上のRNAとハイブリダイズします。ハイブリダイゼーションの効率と特異性に影響を与える可能性のある実験条件には、イオン強度、粘度、二重鎖の長さ、ミスマッチ塩基対、および塩基組成が含まれます。^{[ 11 ]} プローブが特異的に結合したことを確認し、バックグラウンド信号の発生を防ぐために、膜を洗浄します。その後、ハイブリッド信号はX線フィルムで検出され、デンシトメトリーによって定量化できます。ノーザンブロットで比較用のコントロールを作成するには、マイクロアレイまたはRT-PCRで確認した後、目的の遺伝子産物を発現しないサンプルを使用することができます。^{[ 11 ]}

ゲル

RNA サンプルは、RNA の二次構造を制限するために変性剤としてホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで分離されることが最も一般的です。 ^{[ 11 ] [ 12 ]}ゲルは臭化エチジウム(EtBr) で染色し、ブロッティング前に UV 光の下で RNA の質と量を観察することができます。^{[ 11 ]}尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動も RNA 分離に使用できますが、断片化 RNA またはマイクロ RNA に最も一般的に使用されます。^{[ 13 ]} 得られた断片のサイズを観察するために、RNA ラダーが電気泳動ゲル上でサンプルと一緒に実行されることがよくありますが、全 RNA サンプルではリボソームサブユニットがサイズマーカーとして機能します。^{[ 11 ]} 大きなリボソームサブユニットは28S（約5kb）、小さなリボソームサブユニットは18S（約2kb）であるため、ゲル上に2つの目立つバンドが現れ、大きい方のバンドは小さい方のバンドのほぼ2倍の強度を持つ。^{[ 11 ] [ 14 ]}

ノーザンブロッティングでは、組織、臓器、発生段階、環境ストレスレベル、病原体感染、および治療経過における特定の遺伝子の発現パターンを観察できます。^{[ 9 ] [ 15 ] [ 17 ]} この技術は、「正常」組織と比較して癌細胞における癌遺伝子の過剰発現と腫瘍抑制遺伝子のダウンレギュレーションを示すために使用されており、^{[ 11 ]}移植臓器の拒絶における遺伝子発現も示されています。^{[ 18 ]} ノーザンブロットでmRNAが豊富に存在することでアップレギュレーションされた遺伝子が観察された場合、サンプルをシーケンスして、その遺伝子が研究者に知られているものか、新しい発見であるかを判断できます。^{[ 18 ]} 特定の条件下で得られた発現パターンは、その遺伝子の機能についての洞察を提供します。 RNAはまずサイズによって分離されるため、1種類のプローブのみを使用する場合、膜上の各バンドのレベルのばらつきから産物のサイズに関する情報が得られ、同じ遺伝子の代替スプライシング産物または反復配列モチーフを示唆することができます。 ^{[ 8 ] [ 14 ]} 遺伝子産物のサイズのばらつきは、転写処理における欠失またはエラーを示すこともあります。既知の配列に沿って使用するプローブターゲットを変更することで、RNAのどの領域が欠落しているかを特定できます。^{[ 2 ]}

遺伝子発現の解析は、RT-PCR、RNase保護アッセイ、マイクロアレイ、RNA-Seq、遺伝子発現の連続解析（SAGE）、ノーザンブロッティングなど、いくつかの異なる方法で行うことができます。^{[ 4 ] [ 5 ]} マイクロアレイは非常によく使用され、通常はノーザンブロットから得られたデータと一致しますが、ノーザンブロッティングは、マイクロアレイでは検出できない遺伝子発現の小さな変化を検出できる場合があります。^{[ 19 ]} マイクロアレイがノーザンブロットよりも優れている点は、一度に数千の遺伝子を可視化できることですが、ノーザンブロッティングは通常、1つまたは少数の遺伝子を調べます。^{[ 17 ] [ 19 ]}

ノーザンブロッティングの問題は、RNaseによるサンプルの分解（サンプルに内在するものと環境汚染によるもの両方）であることが多いが、これはガラス器具の適切な滅菌とDEPC（ジエチルピロカーボネート）などのRNase阻害剤の使用によって回避できる。^{[ 5 ]} ノーザンブロットのほとんどで使用される化学物質は、ホルムアルデヒド、放射性物質、臭化エチジウム、DEPC、および紫外線がすべて特定の曝露下で有害であるため、研究者にとってリスクとなる可能性がある。^{[ 11 ]} RT-PCRと比較すると、ノーザンブロッティングは感度が低いが、特異性も高く、偽陽性結果を減らす上で重要である。^{[ 11 ]}

ノーザンブロッティングを使用する利点としては、RNAサイズの検出、代替スプライス産物の観察、部分相同性プローブの使用、ブロッティング前にゲル上でRNAの質と量を測定できること、ブロッティング後何年も膜を保存して再プローブできることなどが挙げられる。^{[ 11 ]}

アセチルコリンエステラーゼmRNAの検出のためのノーザンブロッティングでは、非放射性技術が放射性技術と比較され、放射性技術と同等の感度であることが判明したが、放射線に対する防護は不要で、時間もかからない。^{[ 20 ]}

研究者は時折、リバースノーザンブロットと呼ばれる手法の変法を用いる。この手法では、基質核酸（膜に固定される）は単離されたDNA断片の集合体であり、プローブは組織から抽出され放射性標識されたRNAである。 1990年代後半から2000年代初頭にかけて広く用いられるようになったDNAマイクロアレイは、基質に固定された単離DNA断片を用い、細胞RNAから作られたプローブとハイブリダイゼーションを行うという点で、リバース手法により近い。このように、当初は一般的ではなかったリバース手法によって、ノーザンブロット解析は遺伝子発現プロファイリングへと発展し、生物の多くの（おそらくすべての）遺伝子の発現をモニタリングすることが可能になった。

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