プレートリーダー

プレートリーダーは、マイクロプレートリーダーまたはマイクロプレートフォトメーターとも呼ばれ、マイクロタイタープレート内のサンプルの生物学的、化学的または物理的イベントを検出するために使用される機器です。これらは、製薬およびバイオテクノロジー業界や学術機関の研究、創薬、^[1]バイオアッセイの検証、品質管理および製造プロセスで広く使用されています。サンプル反応は、1〜1536ウェル形式のマイクロタイタープレートでアッセイできます。学術研究室や臨床診断室で使用される最も一般的なマイクロプレート形式は、96ウェル（8 x 12マトリックス）で、通常の反応容量はウェルあたり100〜200μLです。より高密度のマイクロプレート（384または1536ウェルのマイクロプレート）は、スループット（1日に処理されるサンプル数）とサンプルあたりのアッセイコストが重要なパラメータとなり、通常のアッセイ容量がウェルあたり5〜50μLになるスクリーニングアプリケーションに通常使用されます。マイクロプレートアッセイの一般的な検出モードは、吸光度、蛍光強度、発光、時間分解蛍光、蛍光偏光です。

方法

吸収度

吸光度検出は、30 年以上前からマイクロプレートリーダーで利用されており、ELISAアッセイ、タンパク質および核酸の定量、酵素活性アッセイ^{[2] (細胞生存率の}MTT アッセイなど) などのアッセイに使用されています。^[3]光源が特定の波長 (光学フィルターまたはモノクロメーターで選択) を使用してサンプルを照射し、ウェルの反対側にある光検出器が、最初の (100%) 光のうちサンプルを透過した光の量を測定します。透過した光の量は通常、対象分子の濃度に関連します。従来の比色分析のいくつかは、研究目的に適した性能で、プレートリーダーで定量的に機能するように小型化されています。プレートリーダー法に変換された分析の例には、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、^[4] 尿素、^[5]鉄 (II)、^[6]およびオルトリン酸の分析がいくつか含まれています。^[7]より最近の比色化学は、プレートリーダーで直接使用するために開発されています。^[8]

蛍光

蛍光強度検出は、過去 20 年間でマイクロプレート形式で非常に幅広く開発されてきました。用途の範囲は吸光度検出を使用する場合よりもはるかに広いですが、機器は通常より高価です。このタイプの機器では、最初の光学系 (励起システム) が特定の波長 (光学フィルターまたはモノクロメーターで選択) を使用してサンプルを照射します。照射の結果、サンプルは光を放射 (蛍光を発します) し、2 番目の光学系 (発光システム) が放射された光を収集し、励起光から分離 (フィルターまたはモノクロメーターシステムを使用) し、光電子増倍管 (PMT) などの光検出器を使用して信号を測定します。蛍光検出が吸光度検出よりも優れている点は、感度と、今日利用できる蛍光ラベルの幅広い選択肢を考慮すると、用途の範囲です。たとえば、カルシウムイメージングと呼ばれる手法では、カルシウム感受性色素の蛍光強度を測定して、細胞内カルシウムレベルを評価します。^[9]

発光

発光は化学反応または生化学反応の結果です。発光は励起用の光源や個別の励起波長を選択するための光学系を必要としないため、発光検出は蛍光検出よりも光学的に簡単です。一般的な発光光学システムは、遮光読み取りチャンバーとPMT検出器で構成されます。プレートリーダーの中には、アナログ PMT 検出器を使用するものもあれば、光子計数PMT 検出器を使用するものもあります。光子計数は、発光を検出する最も感度の高い方法として広く認められています。プレートリーダーの中には、特定の発光波長を選択するためのフィルターホイールまたは波長可変モノクロメーター光学システムを提供するものもあります。複数の波長、または波長範囲を選択できる機能により、複数の発光レポーター酵素を含むアッセイの検出、新しい発光アッセイの開発、および信号対雑音比を最適化する手段が可能になります。^{[引用が必要]}

一般的な用途としては、ルシフェラーゼベースの遺伝子発現アッセイ、 ATPの発光検出に基づく細胞生存率、細胞毒性、生体リズムアッセイなどがある。^[10]

時間分解蛍光（TRF）

時間分解蛍光 (TRF) 測定は、蛍光強度 (FI) 測定と非常によく似ています。唯一の違いは、励起/測定プロセスのタイミングです。FI を測定する場合、励起プロセスと発光プロセスは同時に行われます。つまり、サンプルから放出される光は、励起が行われている間に測定されます。発光システムは、励起光が検出器に到達する前に非常に効率的に除去しますが、励起光の量と発光光の量を比較すると、FI 測定では常にかなり高いバックグラウンド信号が示されます。TRF は、この問題に対する解決策を提供します。TRF は、励起後長時間 (ミリ秒単位で測定) にわたって発光するという珍しい特性を持つ、非常に特殊な蛍光分子(ランタニド) を使用します。一方、ほとんどの標準的な蛍光染料 (フルオレセインなど) は、励起後数ナノ秒以内に発光します。その結果、パルス光源 (キセノンフラッシュランプやパルスレーザーなど) を使用してランタニドを励起し、励起パルスの後に測定することが可能になります。これにより、標準的な FI アッセイよりも測定バックグラウンドが低くなります。欠点は、機器と試薬が通常より高価であることと、アプリケーションがこれらの非常に特殊なランタニド染料の使用と互換性がなければならないことです。TRF の主な用途は、TR-FRET (時間分解蛍光エネルギー移動) と呼ばれる形式での薬物スクリーニングアプリケーションです。TR- FRETアッセイは非常に堅牢で (いくつかの種類のアッセイ干渉に対する感度が限られています)、小型化も容易です。堅牢性、自動化、小型化の能力は、スクリーニングラボでは非常に魅力的な機能です。^{[引用が必要]}

蛍光偏光

蛍光偏光測定も FI 検出に非常に似ています。違いは、光学システムには光路上に偏光フィルターが含まれていることです。マイクロプレート内のサンプルは、偏光を使用して励起されます (FI および TRF モードの非偏光ではなく)。ウェル内の蛍光分子の移動度に応じて、放出される光は偏光するか、または偏光しません。たとえば、溶液中の大きな分子 (タンパク質など) は、サイズのために比較的ゆっくりと回転しますが、偏光で励起されると偏光を放出します。一方、小さな分子は高速で回転するため、信号は脱偏光されます。プレートリーダーの放出システムは、偏光フィルターを使用して放出された光の極性を分析します。偏光レベルが低い場合は、小さな蛍光分子がサンプル内で自由に動いていることを示します。偏光レベルが高い場合は、蛍光がより大きな分子複合体に付着していることを示します。その結果、FP 検出の基本的な用途の 1 つは分子結合アッセイです。これは、小さな蛍光分子がより大きな非蛍光分子に結合するかどうか (または結合しないかどうか) を検出できるためです。結合すると、蛍光分子の回転速度が遅くなり、信号の偏光が増加します。^{[引用が必要]}

光散乱と比濁法

光散乱法と比濁法は、溶液の濁度（溶液中の不溶性粒子）を測定する方法です。光線がサンプルを通過し、光は浮遊粒子によって散乱されます。測定された前方散乱光は、溶液中に存在する不溶性粒子の量を示します。比濁法/光散乱法の一般的な用途には、自動 HTS 薬物溶解度スクリーニング、長期微生物増殖速度、凝集、凝集、および免疫沈降を含む重合および沈殿のモニタリングなどがあります。^{[引用が必要]}

機器とアッセイ

検出モード (吸光度、蛍光強度、発光、時間分解蛍光、蛍光偏光) の多くは、専用のプレートリーダーで単独で使用できますが、現在では 1 つの機器 (マルチモードプレートリーダー) に統合されているものも非常に多く見られます。また、マイクロプレート内のサンプルから散乱する動的または静的な光を測定する機器もあります。マルチモードプレートリーダーの用途は非常に広範囲です。最も一般的なアッセイには次のものがあります。

ELISA法
タンパク質および細胞増殖アッセイ
タンパク質間相互作用
レポーターアッセイ
核酸定量
分子相互作用
酵素活性
細胞毒性、増殖、生存率
ATP定量
免疫測定法^[11]
創薬における化合物およびターゲットのハイスループットスクリーニング（ほとんどの機器でアルファスクリーンと表示） ^[12]
ビーズベースのエピトープアッセイ^[13]
ナノ粒子の細胞内取り込み^[14]

「プレートリーダー」は通常、上記のデバイスを指しますが、さまざまなバリエーションがあります。マイクロプレートフォーマットで動作するその他のデバイスの例を次に示します。

ELISPOTプレートリーダー。ELISPOT アッセイの過程で形成される色のスポットをカウントするために使用されます。
マイクロプレートのすべてのウェルを一度に測定できる高スループットイメージャー
細胞集団を観察するために、各ウェルを高解像度で画像化するハイコンテントスクリーニング（HCS）システム
化学マーカーを使用せずに結合イベントを測定するために特殊なマイクロプレートを使用するラベルフリー機器

参考文献

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