ハイスループットスクリーニング

ハイスループットスクリーニング（HTS）は科学的発見のための方法であり、特に創薬で使用され、生物学、材料科学^[1]、化学[ ^2]の分野に関連しています。^{[3 ]}ロボット工学、データ処理/制御ソフトウェア、液体処理装置、高感度検出器を使用することで、ハイスループットスクリーニングにより、研究者は数百万もの化学、遺伝学、または薬理学のテストを迅速に実施できます。このプロセスを通じて、特定の生体分子経路を調節する活性化合物、抗体、または遺伝子を迅速に認識できます。これらの実験の結果は、薬物設計や、特定の場所の非相互作用または役割を理解するための出発点となります。

HTS の重要な実験器具または試験容器はマイクロタイター プレートです。これは通常使い捨てのプラスチック製の小さな容器で、ウェルと呼ばれる小さな開いたくぼみが格子状に並んでいます。一般に、HTS 用のマイクロプレートには 96、192、384、1536、3456、または 6144 のウェルがあります。これらはすべて 96 の倍数で、8 x 12 の間隔で 9 mm 間隔で配置された元の 96 ウェル マイクロプレートを反映しています。ほとんどのウェルには、実験の性質に応じて、試験項目が入っています。これらは、ジメチルスルホキシド(DMSO)の水溶液などに溶解したさまざまな化合物である可能性があります。ウェルには、何らかの種類の細胞または酵素が入っていることもあります。(他のウェルは空の場合もあれば、実験コントロールとして使用するための純粋な溶媒または未処理のサンプルが入っている場合もあります。)

スクリーニング施設には通常、ストック プレートのライブラリがあり、その内容は注意深くカタログ化されており、各プレートは研究室で作成されたか、商業ソースから入手された可能性があります。これらのストック プレート自体は実験で直接使用されることはありません。代わりに、必要に応じて別のアッセイ プレートが作成されます。アッセイ プレートは、ストック プレートの単なるコピーであり、ストック プレートのウェルから少量の液体 (多くの場合、ナノリットル単位で測定) をピペットで完全に空のプレートの対応するウェルに移すことによって作成されます。

アッセイの準備として、研究者はプレートの各ウェルに、実験を行う対象となるタンパク質、細胞、動物の胚などの生物学的実体を入れます。生物学的実体がウェル内の化合物を吸収、結合、または反応する（または反応しない）ための培養時間が経過した後、手動または機械によって、プレートのすべてのウェルの測定が行われます。手動測定は、研究者が顕微鏡を使用して（たとえば）ウェル内の化合物によって引き起こされる胚の発達の変化または欠陥を探す場合、コンピューターだけでは簡単に判断できない影響を探す場合によく必要になります。それ以外の場合は、専用の自動分析マシンを使用して、ウェルに対していくつかの実験（偏光を照射して反射率を測定するなど、タンパク質結合の指標となる場合があります）を実行できます。この場合、マシンは各実験の結果を数値のグリッドとして出力し、各数値は単一のウェルから取得された値にマッピングされます。大容量の分析装置では、このように数分間で数十枚のプレートを測定し、数千の実験データポイントを非常に迅速に生成できます。

この最初のアッセイの結果に応じて、研究者は、興味深い結果が得られたソース ウェルから液体 (「ヒット」と呼ばれる) を「厳選」して新しいアッセイ プレートに入れ、その後、実験を再実行してこの絞り込まれたセットに関するさらなるデータを収集し、観察結果を確認して改良することで、同じスクリーン内でフォローアップ アッセイを実行できます。

自動化はHTS の有用性において重要な要素です。通常、1 台以上のロボットで構成される統合ロボットシステムは、アッセイ マイクロプレートをステーションからステーションへと移動させ、サンプルと試薬の追加、混合、インキュベーション、そして最後に読み取りまたは検出を行います。HTS システムは通常、多数のプレートを同時に準備、インキュベーション、分析できるため、データ収集プロセスがさらに高速化されます。現在、1 日に最大 100,000 の化合物をテストできる HTS ロボットが存在します。^{[4] [5]} 自動コロニー ピッカーは、ハイ スループット遺伝子スクリーニングのために何千もの微生物コロニーをピックアップします。^{[6] uHTS または}超ハイ スループット スクリーニングという用語は、(2008 年頃) 1 日に 100,000 を超える化合物をスクリーニングすることを指します。^[7]

HTS は、活性化合物を特定するために多様な化合物 (小分子やsiRNAなど) を迅速にスクリーニングする能力を備えており、近年、生成されるデータ速度が爆発的に増加しています。^[8] その結果、HTS 実験における最も基本的な課題の 1 つは、大量のデータから生化学的意義を収集することであり、これは、品質管理とヒット選択の両方のための適切な実験設計と分析方法の開発と採用に依存しています。^[9] HTS 研究は、Applied Proteomics, Inc. の最高科学責任者である John Blume が次のように説明する特徴を持つ分野の 1 つです。「近い将来、科学者が統計や基本的なデータ処理技術を理解していない場合、真の分子生物学者とは見なされなくなり、単に「恐竜」になってしまうでしょう。」^[10]

高品質の HTS アッセイは、HTS 実験において極めて重要です。高品質の HTS アッセイの開発には、品質管理 (QC) のための実験的アプローチと計算的アプローチの両方の統合が必要です。QC の 3 つの重要な手段は、(i) 適切なプレート設計、(ii) 効果的な陽性および陰性の化学的/生物学的コントロールの選択、(iii) データ品質の劣るアッセイを識別できるように分化の程度を測定する効果的な QC メトリクスの開発です。 ^[11] 適切なプレート設計は、系統的エラー (特にウェルの位置に関連するエラー) を識別し、QC とヒット選択の両方に対する系統的エラーの影響を除去/軽減するために使用する正規化を決定するのに役立ちます。^[9]

効果的な分析品質管理法は、優れた品質のアッセイのゲートキーパーとして機能します。一般的な HTS 実験では、陽性コントロールと陰性コントロールなどの陰性参照との明確な区別が、優れた品質の指標となります。陽性コントロールと陰性参照の区別の程度を測定するために、多くの品質評価尺度が提案されています。信号対背景比、信号対雑音比、信号ウィンドウ、アッセイ変動比、およびZ 係数が、データ品質の評価に採用されています。 ^{[9] [12]} 厳密に標準化された平均差 ( SSMD ) は、最近、HTS アッセイのデータ品質を評価するために提案されました。 ^{[13] [14]}

HTSにおいて望ましい効果の大きさを持つ化合物はヒットと呼ばれます。ヒットを選択するプロセスはヒット選択と呼ばれます。反復のないスクリーニング（通常は一次スクリーニング）におけるヒット選択の分析方法は、反復のあるスクリーニング（通常は確認スクリーニング）におけるヒット選択の分析方法とは異なります。たとえば、zスコア法は反復のないスクリーニングに適していますが、t統計量は反復のあるスクリーニングに適しています。反復のないスクリーニングのSSMDの計算も、反復のあるスクリーニングの計算とは異なります。^[9]

反復のない一次スクリーニングでのヒット選択では、平均倍率変化、平均差、阻害率、活性率が簡単に解釈できる。しかし、これらはデータの変動を効果的に捉えることができない。zスコア法またはSSMDは、すべての化合物がスクリーニングの陰性参照と同じ変動性を持つという仮定に基づいてデータの変動性を捉えることができる。 ^{[15] [16]} しかし、HTS実験では外れ値が一般的であり、zスコアなどの方法は外れ値の影響を受けやすく、問題となる可能性がある。その結果、z*スコア法、SSMD*、Bスコア法、分位点ベース法などの堅牢な方法がヒット選択に提案され、採用されてきた。^{[5] [9] [17] [18]}

反復試験によるスクリーニングでは、各化合物の変動性を直接推定できます。したがって、z スコアや z* スコアが依存する強い仮定に依存しない SSMD または t 統計量を使用する必要があります。t 統計量と関連する p 値の使用に関する 1 つの問題は、サンプル サイズと効果サイズの両方の影響を受けることです。^[19] これらは平均差がないことをテストすることから得られるため、複合効果のサイズを測定するようには設計されていません。ヒット選択の場合、主な関心はテストされた化合物の効果のサイズです。SSMD は効果のサイズを直接評価します。^[20] SSMD は、一般的に使用される他の効果サイズよりも優れていることも示されています。^[21] SSMD の母集団値は実験間で比較可能であるため、SSMD の母集団値に同じカットオフを使用して複合効果のサイズを測定できます。^[22]

1 枚または複数のプレートに化合物を独自に分散させることで、プレートあたりのアッセイ数を増やすか、アッセイ結果のばらつきを減らすか、またはその両方を実現できます。このアプローチで行われる単純化された仮定は、同じウェル内の N 個の化合物は通常、アッセイが真のヒットを検出する能力を根本的に変えるような方法で、互いに、またはアッセイ ターゲットと相互作用しないというものです。

たとえば、化合物 A がウェル 1、2、3、3、化合物 B がウェル 2、3、4、化合物 C がウェル 3、4、5 にあるプレートを想像してください。このプレートを特定のターゲットに対してアッセイすると、ウェル 2、3、4 でヒットがあった場合、化合物 B が最も可能性の高い薬剤であることが示され、指定されたターゲットに対する化合物 B の有効性の測定値も 3 回得られます。このアプローチの商業的応用には、スクリーニングされる化合物のペア間の干渉の (二次的な) 可能性を減らすために、2 つの化合物が 1 つ以上のウェルを共有することのない組み合わせが含まれます。

NIH化学ゲノムセンター（NCGC）の科学者は、自動化と低容量アッセイ形式を活用して、各化合物の完全な濃度反応関係を生成することで大規模な化学ライブラリを薬理学的にプロファイリングするパラダイムである定量的HTS（qHTS）を開発しました。付随するカーブフィッティングおよびケモインフォマティクスソフトウェアを使用すると、qHTSデータはライブラリ全体の最大有効濃度の半分（EC50）、最大反応、ヒル係数（nH）を生成し、新生構造活性相関（SAR）の評価を可能にします。^[23]

2010年3月、液滴ベースのマイクロ流体工学を用いた従来の技術よりも1,000倍高速なスクリーニング（10時間で1億回の反応）を100万分の1のコスト（10 ⁻⁷倍の試薬量を使用）で実現するHTSプロセスを実証した研究が発表されました。^[23]油で分離された液滴がマイクロプレートのウェルに取って代わり、試薬がチャネルを流れている間に分析とヒットソーティングが可能になります。

2010年に研究者らは、マイクロ流体アレイ上に配置できるシリコンシートのレンズを開発し、1台のカメラで同時に64の異なる出力チャネルの蛍光測定を可能にしました。^[24] このプロセスでは、1秒間に20万滴を分析できます。

2013 年、研究者らは植物由来の小分子を用いたアプローチを公開しました。一般的に、創薬プロセスの早い段階で高品質の概念実証検証を提供することが不可欠です。ここで、強力で選択的かつ生物学的に利用可能な化学プローブの特定を可能にする技術は、結果として得られる化合物が医薬品として開発されるためにさらなる最適化を必要とする場合でも、非常に重要な関心事です。強力で生物学的に利用可能なアゴニストを特定するために 10 年以上ターゲットとされてきたタンパク質である核受容体 RORα は、非常に困難な薬物ターゲットの例として使用されました。ベル型曲線のため、ヒットはスクリーニング段階で確認されます。この方法は、定量的 HTS 法 (スクリーニングとヒット確認を同時に行う) と非常に似ていますが、このアプローチを使用するとデータ ポイント数が大幅に減少し、100,000 を超える生物学的関連化合物を簡単にスクリーニングできる点が異なります。^[25]

メルク社は、24時間の粉砕時間と少なくとも10mgの薬物化合物を必要とするオービタルシェーカーからレゾナントアコースティックミキサーに切り替えた結果、ウェルあたりわずか1～2mgの薬物化合物で処理時間を2時間未満に短縮したと報告している。また、メルク社は、アコースティックミリングアプローチにより、従来のミリング装置では得られなかった高用量ナノサスペンション製剤の調製が可能になると指摘している。^[26]

従来のHTS創薬では精製されたタンパク質や無傷の細胞が使われてきましたが、最近の技術開発では線虫Caenorhabditis elegansやゼブラフィッシュ（Danio rerio）のような無傷の生物が使用されるようになりました。^[27]

2016年から2018年にかけて、プレートメーカーは、超低接着性細胞忌避表面の大量生産を可能にする特殊な化学薬品の製造を開始し、より生理学的に関連性の高いフォーマットであるオルガノイドやスフェロイドなどの3D組織での癌治療薬の発見に対処するためのHTS適応アッセイの急速な開発を促進しました。^{[28] [29] [30]}

HTS は比較的最近のイノベーションであり、主にロボット工学と高速コンピュータ技術の現代の進歩によって実現可能になりました。HTS オペレーションを実行するには、高度に専門化された高価なスクリーニング ラボが依然として必要であるため、多くの場合、小規模から中規模の研究機関は、独自の HTS 施設を設置するのではなく、既存の HTS 施設のサービスを利用します。

学界では、大学が自ら創薬企業となる傾向がある。^[31]通常、産業界にしかないこうした施設が、今では大学にも増えてきている。例えば、 UCLAには、オープンアクセスのHTS研究所である分子スクリーニング共有リソース（MSSR、UCLA）があり、日常的に1日10万以上の化合物をスクリーニングできる。オープンアクセスポリシーにより、世界中の研究者が長い知的財産交渉なしにこの施設を利用できることが保証されている。20万以上の小分子の化合物ライブラリを擁するMSSRは、西海岸の大学の中でも最大級の化合物デッキを擁している。また、MSSRは、小分子研究を補完する完全な機能ゲノミクス機能（ゲノムワイドsiRNA、shRNA、cDNA、CRISPR）を備えている。機能ゲノミクスでは、HTS機能を活用してゲノムワイドスクリーニングを実行し、各遺伝子をノックアウトまたは過剰発現させることで、対象のコンテキストで各遺伝子の機能を調べる。ハイスループットの小分子スクリーニングとゲノムワイドスクリーニングを並行して利用することで、研究者は特定の疾患のターゲットの特定と検証、または小分子の作用機序の決定を行うことができます。最も正確な結果は、「アレイ化された」機能ゲノミクスライブラリを使用することで得られます。つまり、各ライブラリには単一の siRNA または cDNA などの単一の構成が含まれています。機能ゲノミクスは、通常、エピ蛍光顕微鏡法やレーザー走査型サイトメトリーなどを使用したハイコンテンツスクリーニングと組み合わせて行われます。

イリノイ大学にも、ミネソタ大学と同様に HTS の施設があります。ミシガン大学の生命科学研究所には、化学ゲノミクスセンター内に HTS 施設があります。コロンビア大学には、生化学、細胞ベース、NGS ベースのスクリーニングに使用できる約 300,000 種類の多様な小分子と約 10,000 種類の既知の生物活性化合物を備えた HTS 共有リソース施設があります。ロックフェラー大学には、オープンアクセスのHTS リソースセンター HTSRC (The Rockefeller University、HTSRC)があり 、380,000 種類を超える化合物のライブラリを提供しています。ノースウェスタン大学のハイスループット分析研究所は、ターゲットの特定、検証、アッセイ開発、および化合物のスクリーニングをサポートしています。非営利のサンフォード バーナム プレビス医療発見研究所も、MLPCN の一部であったコンラッド プレビス化学ゲノミクスセンター内に長年にわたる HTS 施設を持っています。非営利のスクリプス研究分子スクリーニングセンター（SRMSC）^[32]は、MLPCN時代以降も引き続き複数の研究所にわたって学術界に貢献しています。SRMSC uHTS施設は、学術界で最大規模のライブラリコレクションの1つを維持しており、現在665,000を超える小分子エンティティを保有しており、複数のPIによる助成金イニシアチブをサポートするために、定期的にコレクション全体またはサブライブラリをスクリーニングしています。

米国では、国立衛生研究所（NIH）が、生物学研究で使用するための革新的な化学ツールを製造するために、全国規模の低分子スクリーニングセンターのコンソーシアムを設立しました。分子ライブラリプローブ生産センターネットワーク（MLPCN）は、中央分子リポジトリに保管されている低分子の大規模なライブラリに対して、研究コミュニティが提供するアッセイでHTSを実行します。さらに、NIHはメリーランド州シェイディグローブに国立トランスレーショナルサイエンス推進センター（NCATS）を設立し、学術研究室と協力して低分子およびRNAiスクリーニングを実施しています。注目すべきは、低分子スクリーニングでは1536ウェルプレートが使用され、これは学術スクリーニング研究室ではめったに見られない機能で、各化合物を4桁から5桁の濃度でテストする定量的HTSを実行できます。^[23]

• Lin, Yibin (2018)。 「ハイスループットタンパク質結晶化スクリーニングの過去5年間で何が起こったか？」。 医薬品発見に関する専門家の意見。13 (8): 691–695。doi : 10.1080 /17460441.2018.1465924。ISSN 1746-0441。PMID  29676184 。
• スタッフ (2008-08-01)。「ハイスループットスクリーニングの課題」。遺伝子工学とバイオテクノロジーニュース。新薬発見に関する円卓討論会。第 28 巻、第 14 号。メアリー アン リーバート。pp. 26–27。ISSN  1935-472X。2008年10 月 1 日に取得。
• Zhang XHD (2011)「最適なハイスループットスクリーニング：ゲノム規模のRNAi研究のための実用的な実験設計とデータ分析、ケンブリッジ大学出版局」
• Florian, Amy; Lepensky, C; Kwon, O; Sklar, L; Haynes, M (201). 「フローサイトメトリーは、細胞傷害性T細胞溶解顆粒エキソサイトーシスのための高スループット均一蛍光抗体結合アッセイを可能にする」。Journal of Biomolecular Screening . 4 (18): 420–429. doi :10.1177/1087057112466697. PMC  4043149. PMID  23160568 .フローサイトメトリーは、細胞傷害性T細胞溶解顆粒放出に対する高スループットの均一蛍光抗体結合アッセイを可能にする
• Florian, Amy E.; Lepensky, Christopher K.; Kwon, Ohyun; Haynes, Mark K.; Sklar, Larry A.; Zweifach, Adam (2013). 「フローサイトメトリーにより、細胞傷害性 T 細胞溶解顆粒放出のための高スループット均一蛍光抗体結合アッセイが可能に」。Journal of Biomolecular Screening . 18 (4): 420–429. doi :10.1177/1087057112466697. ISSN  1087-0571. PMC  4043149. PMID  23160568 .

• オープンスクリーニング環境
• ハイスループットスクリーニングラボの設置 (Koppal、Lab Manager Magazine)
• アッセイガイダンスマニュアル (NIH、NCGC)
• OncoSignature ハイスループットスクリーニング