脂質二重層の特性評価

脂質二重層の特性評価とは、さまざまな光学的、化学的、物理的プローブ法を用いて脂質二重層の特性を研究することです。脂質二重層の基本的な性質上、研究が非常に困難な構造であるため、これらの技術の多くは複雑で高価な装置を必要とします。個々の二重層はわずか数ナノメートルの厚さしかないため、従来の光学顕微鏡では見えません。また、二重層は非共有結合のみで結合しているため、比較的壊れやすい構造であり、水から取り出すと不可逆的に破壊されます。これらの制約にもかかわらず、過去70年間で、二重層の構造と機能の研究を可能にする数十の技術が開発されてきました。最初の一般的なアプローチは、二重層の特性を測定するものの、実際に二重層を画像化するわけではない、 X線回折や電気抵抗などの非破壊的なin situ測定を利用することでした。その後、二重層を修飾して直接可視化するためのプロトコルが開発され、最初は電子顕微鏡で、そして最近では蛍光顕微鏡で可視化できるようになりました。過去20年間、AFMをはじめとする新世代の特性評価ツールの登場により、化学的または物理的な改変をほとんど、あるいは全く加えることなく、膜をその場で直接観察・画像化することが可能になった。さらに近年では、二重偏光干渉法を用いて脂質二重層の光学的複屈折を測定し、相互作用や環境影響に伴う秩序や破壊を特徴づける手法が用いられている。

蛍光顕微鏡法は、特定の分子をある波長の光で励起すると、より長い波長の光を放出させる技術です。蛍光分子はそれぞれ固有の吸収スペクトルと発光スペクトルを持つため、特定の種類の分子の位置を特定することができます。天然の脂質は蛍光を発しないため、蛍光顕微鏡法で脂質二重層を研究するには、必ず色素分子を添加する必要があります。色素分子の添加は、ある程度、系に変化をもたらし、場合によっては、観察された効果が脂質によるものなのか、色素によるものなのか、あるいは最も一般的なのは両者の組み合わせによるものなのかを判断するのが難しいことがあります。色素は通常、脂質または脂質によく似た分子に結合しますが、色素ドメインは比較的大きいため、この他の分子の挙動を変化させる可能性があります。これは、脂質の拡散や相分離を研究する際に特に議論の的となる問題です。なぜなら、これらのプロセスはどちらも、関与する分子のサイズと形状に非常に敏感だからです。

この潜在的な合併症は、光退色後の蛍光回復法（FRAP）を用いて二重層の拡散係数を決定することに対する反対意見として挙げられています。典型的なFRAP実験では、小さな 領域（直径約30μm）を強い光源に照射して光退色させます。その後、この領域を時間経過とともに監視し、「死んだ」色素分子が拡散して周囲の二重層から無傷の色素分子に置き換わる様子を観察します。この回復曲線にフィッティングすることで、二重層の拡散係数を計算することができます。[ ^{1 ] [ 2 ]この}手法の使用に対する反対意見は、実際に研究されているのは脂質ではなく色素の拡散であるという点です。^{[ 3 ]}これは正しいものの、色素の移動度は二重層の移動度によって支配されることが多いため、この区別は必ずしも重要ではありません。

従来の蛍光顕微鏡では、解像度は使用する光の波長の約半分に制限されていました。共焦点顕微鏡と画像処理を使用することでこの制限を拡張できますが、通常は100ナノメートルよりはるかに小さくはなりません。これは典型的な細胞よりはるかに小さいですが、脂質二重層の厚さよりはるかに大きいです。より最近では、高度な顕微鏡法により、特定の条件下では、サブナノメートルまで、はるかに高い解像度が可能になりました。最初に開発されたこれらの方法の1つは、Förster共鳴エネルギー移動（FRET）です。FRETでは、2つの色素分子が、一方の発光スペクトルが他方の吸収スペクトルと重なるように選択されます。このエネルギー移動は距離に非常に依存するため、2つの色素がどれだけ離れているかをオングストロームの解像度で判断できます。これは、たとえば、2つの二重層が融合してその構成要素が混ざり合うタイミングを決定するために使用できます。^{[ 4 ]}もう1つの高解像度顕微鏡技術は、蛍光干渉コントラスト顕微鏡（FLIC）です。この方法では、サンプルを精密にマイクロ加工された反射面上にマウントする必要があります。形成された破壊的干渉パターンを研究することにより、支持された二重膜の2つのリーフレットを個別に分離し、それぞれの中の蛍光色素の分布を決定することが可能です。^{[ 5 ]}

電気測定は、二重層の最も重要な機能の 1 つ、すなわち溶液中のイオンを分離して流れを阻止する能力を特徴付ける最も直接的な方法です。したがって、電気特性評価は、黒色膜などのモデルシステムの特性を研究するために使用された最初のツールの 1 つでした。細胞膜がイオン勾配を維持できること、そしてこの勾配がニューロンが活動電位を介して信号を送る能力の原因であることはすでに知られていました。同様の現象が試験管内で再現できることを実証することは、モデルシステムの有用性の重要な検証でした。^{[ 6 ]}

基本的に、二重膜の電気的測定では、膜の両側に電極を配置します。これらの電極間にバイアスを印加し、結果として生じる電流を測定することで、二重膜の抵抗を決定できます。この抵抗は、無傷の二重膜では通常非常に高く、疎水性コアが荷電水和種に対して不透過性であるため、100 GΩを超えることがよくあります。この抵抗が非常に大きいため、数ナノメートルスケールの穴が存在するだけでも電流が劇的に増加し、容易に決定できます。^{[ 7 ]}このシステムの感度は、単一のイオンチャネルの活動さえも分解できるほどです。^{[ 8 ]}このような直流測定では、片側に必要な正電荷ともう片側に負電荷を供給するために、電気化学的に活性な電極を使用する必要があります。最も一般的なシステムは銀/塩化銀電極です。この反応は安定で可逆的であり、単一の電子移動を伴い、大きな電流を生成できるためです。^{[ 9 ]}単純な直流電流測定に加えて、交流電気特性評価を実行して、二重層の静電容量と複素インピーダンスに関する情報を抽出することも可能である。静電容量は厚さに反比例し、二重層は非常に薄いため、通常、2  μF/cm ²オーダーの非常に大きな静電容量を持つ。静電容量測定は、溶媒/脂質プラグが単一の二重層に薄くなるタイミングを決定するために使用できるため、黒色脂質膜を扱う場合に特に有用である。

脂質は極性の高い分子であり、自己組織化して二重層を形成すると、平行方向の光学的特性が垂直方向の光学的特性と大きく異なる、非常に複屈折性の高い層を形成します^{[ 10 ]}。この効果は、二重偏光干渉法によって研究され、温度、イオン強度、および抗菌ペプチドなどの分子間相互作用による層の動的な再編成を測定するために使用されています。

^{水和した二重層は豊かな振動ダイナミクスを示し、効率的な振動エネルギー伝達に適した媒体です。脂質単層および二重層の振動特性は、超高速分光技術[ 11 ]および最近開発された計算手法[ 12 ]}によって調査されています 。

近年、原子間力顕微鏡（AFM）は、脂質二重層の物理的特性を画像化および調査するために使用されています。AFMは、室温および水中（自然な二重層の挙動に必要な条件）でもナノメートル分解能で画像化できる可能性があるため、有望な技術です。これらの機能により、支持された二重層における微妙なリップル相転移を直接画像化することが可能になりました。 ^{[ 13 ]}水性緩衝媒体中でタッピングモードで実行された別のAFM実験により、（1） 脂質二重層形成中に記録された一連のAFM画像から差し引くことにより、直径約1.2～22 nmのナノ粒子の周囲に膜貫通孔（穴）の形成を決定し、（2）露出したナノ粒子への単一のインスリン分子の吸着を観察することができました。^{[ 14 ]}もう一つの利点は、プローブ先端が二重層表面と機械的に相互作用するため、AFMでは脂質の蛍光標識や同位体標識を 必要としないことです。このため、同じスキャンで、二重層とそれに関連する構造の両方に関する情報を明らかにすることができ、個々の膜タンパク質を解像できるほどです。^{[ 15 ]}画像化に加えて、AFMは、脂質二重層などの小さく繊細な構造の機械的性質を調べることもできます。ある研究では、多孔質陽極酸化アルミニウム上に懸架された個々のナノスケール膜の弾性率を測定できる可能性が実証されました。^{[ 16 ]}

AFMは脂質二重層を研究するための強力で汎用性の高いツールですが、実際的な制限や困難もいくつかあります。二重層は壊れやすいため、損傷を避けるために非常に低い走査力（通常50pN以下^{[ 13 ] [ 17 ]}）を使用する必要があります。この点は、基板上に吸着した小胞などの準安定系を研究する場合に特に重要です。AFMチップが破裂やその他の構造変化を引き起こす可能性があるためです。^{[ 18 ]}また、疎水性表面は脂質と強く相互作用して二重層構造を破壊する可能性があるため、AFMチップに適した材料と表面処理を選択することにも注意が必要です。^{[ 19 ]}

電子顕微鏡では、従来の顕微鏡のように光線ではなく、集束された電子のビームが試料と相互作用します。電子は光よりもはるかに波長が短いため、電子顕微鏡は光顕微鏡よりもはるかに高い解像度を持ち、原子スケールまで到達する可能性があります。脂質二重層は分子レベルで配置されているため、この高い解像度は非常に貴重です。1960年、二重層の構造がまだ議論されていたとき、対向する2つのリーフレットを初めて直接可視化したのは電子顕微鏡でした。^{[ 20 ]}急速凍結技術と併用して、電子顕微鏡は細胞間および細胞内輸送のメカニズムの研究にも使用されており、たとえば、シナプスでの化学物質放出の手段がエキソサイトーシス小胞であることを示すのに使用されています。^{[ 21 ]}多くの場合、電子顕微鏡は、複雑なナノメートルスケールの形態を決定するのに十分な解像度を持つ唯一のプローブ技術です。

脂質構造の研究における電子顕微鏡の限界は、主に試料調製に関するものです。ほとんどの電子顕微鏡は試料を真空下に置く必要があり、これは室温での水和とは相容れません。この問題を克服するために、試料を極低温条件下で凍結させて観察するか、凍結した試料から金属ネガを作成することができます。また、脂質の低原子量成分（炭素、窒素、リンなど）は水に比べてコントラストが低いため、通常は四酸化オスミウムや酢酸ウラニルなどの重金属化合物で二重層を染色する必要があります。透過型電子顕微鏡（TEM）を使用する場合は、試料を非常に薄い（1マイクロメートル未満）シート状に切断または研磨する必要がありますが、これは困難で時間のかかる作業です。走査型電子顕微鏡（SEM）ではこの工程は不要ですが、TEMと同じ解像度は得られません。どちらの方法も表面に敏感な技術であり、深部構造に関する情報は得られません。

X線と高エネルギー中性子は、関連する（オングストローム～ナノメートル）長さスケールで物質と相互作用するように調整できるため、二重層を含む生物学的構造の構造と周期性を調べるために使用されています。多くの場合、これら2種類の実験は、それぞれ異なる利点と欠点があるため、相補的な情報を提供します。X線は水と弱くしか相互作用しないため、比較的簡単なサンプル調製でバルクサンプルを調べることができます。これが、X線散乱が二重層間隔を体系的に研究するために最初に使用された技術である理由の1つです。^{[ 22 ]} X線散乱は、個々の脂質分子間の平均間隔に関する情報も提供できるため、相転移の特性評価に使用されています。^{[ 23 ]} X線技術の1つの制限は、X線が水素などの軽い元素に対して比較的感度が低いことです。この効果は、X線が原子番号の減少とともに減少する電子密度からの散乱によって物質と相互作用するという事実の結果です。対照的に、中性子は核密度と核磁場によって散乱されるため、感度はzとともに単調に減少しません。このメカニズムは、場合によっては、特に水素と重水素の間で強い同位体コントラストも提供し、研究者は水と重水素化水を混合することによって実験のベースラインを調整できます。中性子や X 線による散乱ではなく反射率測定を使用すると、実験者は支持された二重層または多層スタックを調べることができます。これらの測定は分析を実行するのがより複雑ですが、二重層内の水の位置と濃度を含む断面組成を決定できます。^{[ 24 ]}中性子と X 線散乱測定の両方の場合、提供される情報はシステムのアンサンブル平均であるため、これらの非常に移動性の高い構造の熱ゆらぎに基づく不確実性の影響を受けます。^{[ 25 ]}