イルミナ色素シーケンス

ゲノムサンプルからDNAを精製するか、cDNAを生成した後、それを断片のライブラリー、ゲノムライブラリーに変換し、装置でシーケンスする必要があります。これには通常、DNA断片化と末端修復およびアダプターライゲーションという2つの重要なステップが含まれます。ゲノムライブラリーを断片化する方法には、超音波処理とタグメンテーションの2つがあります。タグメンテーションでは、修飾トランスポザーゼがDNAを50～500 bpの断片にランダムに切断し、同時にアダプターを追加します。^{[ 6 ]}超音波を使用してゲノムDNAを同様のサイズに断片化するために超音波処理を使用することによっても、遺伝子ライブラリーを生成できます。次に、 T7 DNAポリメラーゼとT4 DNAリガーゼを使用して、特殊なアダプターを断片の右端と左端にライゲーションします。アダプターがライゲーションされなかった鎖は洗い流されます。^{[ 7 ]}

アダプターには、固体支持体（フローセル上のオリゴヌクレオチド）に相補的な配列、バーコード配列（インデックス）、およびシーケンスプライマーの結合部位という 3 つの異なるセグメントが含まれています。 ^{[ 6 ]}インデックスは通常 6 塩基対の長さで、DNAシーケンス解析 中にサンプルを識別するために使用されます。インデックスを使用すると、最大 96 種類のサンプルを同時に実行できます。これはマルチプレキシングとも呼ばれます。解析中、コンピューターは同じインデックスを持つすべてのリードをグループ化します。^{[ 8 ] [ 9 ]} Illumina は「合成によるシーケンス」アプローチを使用しています。^{[ 9 ]}このプロセスは、アクリルアミドでコーティングされたガラスフローセル内で行われます。^{[ 10 ]}フローセルの底にはオリゴヌクレオチド（短いヌクレオチド配列）がコーティングされており、シーケンス中に DNA 鎖を所定の位置に保持する固体支持体として機能します。断片化された DNA がフローセル上を洗浄されると、適切なアダプターが相補的な固体支持体に結合します。

いったん結合すると、クラスター生成を開始できます。目標は、数百本の同一のDNA鎖を作成することです。一部は順方向鎖、残りは逆方向鎖になります。これが、右および左アダプターが使用される理由です。クラスターはブリッジ増幅によって生成されます。DNAポリメラーゼはDNA鎖に沿って移動し、その相補鎖を作成します。元の鎖は洗い流され、逆方向鎖だけが残ります。逆方向鎖の上部にはアダプター配列があります。DNA鎖は曲がり、上部のアダプター配列に相補的なオリゴに結合します。ポリメラーゼは逆方向鎖に結合し、その相補鎖（元の鎖と同一）が作成されます。これで二本鎖になったDNAは変性され、各鎖がフローセルに固定されたオリゴヌクレオチド配列に別々に結合できるようになります。一方は逆方向鎖、もう一方は順方向鎖になります。このプロセスはブリッジ増幅と呼ばれ、フローセル全体で一度に数千のクラスターに対して行われます。^{[ 11 ]}

DNA鎖は何度も曲がり、固体支持体に付着します。DNAポリメラーゼは新しい鎖を合成して二本鎖セグメントを作成し、それが変性して、ある領域のすべてのDNA鎖が単一のソース（クローン増幅）からになります。クローン増幅は品質管理の目的で重要です。鎖に異常な配列が見つかった場合、科学者は逆鎖をチェックして、同じ異常の相補配列があることを確認できます。順鎖と逆鎖は、アーティファクトを防ぐためのチェックとして機能します。IlluminaシーケンスはDNAポリメラーゼを使用するため、塩基置換エラーが観察されています^{[ 12 ]} 、特に3'末端で^{[ 13 ]} 。ペアエンドリードとクラスター生成を組み合わせることで、エラーが発生したことを確認できます。逆鎖と順鎖は互いに相補的である必要があり、すべての逆リードは互いに一致し、すべての順リードは互いに一致する必要があります。リードが対応するリード（クローンであるべきもの）と十分に類似していない場合、エラーが発生した可能性があります。一部の研究室の分析では、97%の類似性という最小閾値が使用されています。^{[ 13 ]}

クローン増幅の最後に、逆鎖はすべて制限酵素でインデックス 2 で切断され、^{[ 14 ]}フローセルから洗い流され、順鎖のみが残ります。プライマーが順鎖のアダプタープライマー結合部位に結合し、ポリメラーゼが蛍光標識された dNTP を DNA 鎖に追加します。蛍光色素がブロッキング グループとして機能するため、1 ラウンドで追加できる塩基は 1 つだけですが、ブロッキング グループが可逆的です。^{[ 6 ]} 4 色化学を使用すると、4 つの塩基それぞれが固有の発光 (A=赤、G=青、T=緑、C=黄) を持ち、^{[ 15 ]}各ラウンドの後、機械はどの塩基が追加されたかを記録します。色が記録されると、蛍光色素が洗い流され、別の dNTP がフローセルに洗い流され、プロセスが繰り返されます。

イルミナは、NextSeq、そして後にMiniSeqの発売を皮切りに、新しい2色シーケンス技術を導入しました。ヌクレオチドは、2色（赤または緑）のいずれか、無色（「黒」）、または両方の色を組み合わせたもの（赤と緑の混合色としてオレンジ色に見える）で区別されます。

DNA鎖の読み取りが完了すると、添加されたばかりの鎖は洗い流されます。次に、インデックス1プライマーが結合し、インデックス1配列を重合させ、洗い流されます。鎖は再びブリッジを形成し、DNA鎖の3'末端がフローセル上のオリゴに結合します。インデックス2プライマーが結合し、配列を重合させ、洗い流されます。

ポリメラーゼは、アーチ状の鎖の上に相補鎖を配列決定します。その後、両鎖は分離し、それぞれの3'末端がブロックされます。順方向鎖はインデックス1部位で切断され、洗い流されます。そして、逆方向鎖についても、合成による配列決定のプロセスが繰り返されます。

数百万個のクラスターに対して一度にシーケンスが行われ、各クラスターには約1,000個の同一のDNA挿入コピーが含まれています。^{[ 12 ]}シーケンスデータは、重複領域を持つ断片（コンティグと呼ばれる）を見つけて並べることで解析されます。参照配列が既知の場合は、コンティグをそれと比較して変異を特定します。

この断片的なプロセスにより、断片化されていない配列が実行されていない場合でも、科学者は完全な配列を見ることができます。ただし、Illumina のリード長はあまり長くないため^{[ 13 ]} (HiSeq シーケンスでは約 90 bp のリード長が得られます^{[ 8 ]} )、短いタンデムリピート領域を解決するのは困難です。^{[ 8 ] [ 12 ]}また、配列が de novo で参照が存在しない場合、反復領域は配列アセンブリに大きな困難を引き起こす可能性があります。^{[ 12 ]}その他の困難には、不正確なポリメラーゼによる塩基置換 (特にリードの 3' 末端^{[ 13 ]} )、キメラ配列、および PCR バイアスがあり、これらはすべて誤った配列の生成につながる可能性があります。^{[ 13 ]}