断片化（細胞生物学）

断片化とは、いくつかの部分またはフラグメントに分割するプロセスを指します。細胞生物学では、断片化はDNA クローニングとアポトーシスの両方において細胞に役立ちます。DNAクローニングは、無性生殖または同一の DNA 分子の作成に重要であり、細胞によって自発的に実行されることもあれば、研究室の研究者によって意図的に実行されることもあります。アポトーシスは、細胞とその中の DNA 分子のプログラムされた破壊であり、高度に制御されたプロセスです。細胞プロセスで断片化が使用されるこれらの 2 つの方法は、正常な細胞機能と、細胞に対して実行される一般的な実験手順を表しています。ただし、細胞内の問題によって断片化が引き起こされ、赤血球の断片化や精子細胞の DNA 断片化などの異常が生じることがあります。

DNA クローニングは、生殖目的で細胞によって自発的に行われることがあります。これは無性生殖の一種で、生物が断片に分裂し、それぞれの断片が成熟した完全に成長した個体に成長し、元の生物のクローンになります (生殖断片化を参照)。DNA クローニングは、研究室の研究者によって意図的に行うこともできます。ここで、DNA 断片化とは、研究者が組換え DNA技術を使用して多数の同一の DNA 分子を準備することを可能にする分子遺伝学的手法です。DNA クローニングを完了するには、特定の遺伝子を構成する生物の DNA の個別の小さな領域を取得する必要があります。比較的小さな DNA 分子のみが、利用可能なベクターでクローニングできます。したがって、生物のゲノムを構成する長い DNA 分子は、ベクター DNA に挿入できる断片に切断する必要があります。^[1] 2 つの酵素が、このような組換え DNA 分子の生成を促進します。

1.制限酵素

制限酵素は細菌によって生成されるエンドヌクレアーゼであり、通常は小さな塩基対配列（制限部位と呼ばれる）を認識し、この部位でDNAの両方の鎖を切断します。^[2]制限部位は通常、回文配列であり、つまり、5'から3'方向に読み取られた場合、制限部位配列はDNAの各鎖で同じです。

細菌は、制限酵素ごとに修飾酵素も生成し、宿主細菌自身のDNAを切断から保護します。これは、各切断部位またはその近くで宿主DNAを修飾することによって行われます。修飾酵素は1つまたは2つの塩基にメチル基を付加し、このメチル基の存在により制限エンドヌクレアーゼによるDNAの切断が防止されます。^[3]

多くの制限酵素は、認識部位で2本のDNA鎖を交互に切断し、両端に張り出した1本の鎖の「尾」を持つ断片（粘着末端）を生成します。制限酵素は、認識部位で2本のDNA鎖を直線的に切断することもでき、これにより平滑末端が生成されます。^[4]

2. DNAリガーゼ

通常のDNA複製中、DNAリガーゼは岡崎断片と呼ばれる短いDNA断片の末端同士の結合（ライゲーション）を触媒する。DNAクローニングの目的で、精製されたDNAリガーゼは、相補末端を持つ制限断片とベクターDNAの末端を共有結合させるために使用される。それらは、DNAの標準的な3'から5'へのホスホジエステル結合を介して共有結合される。^[5]

DNAリガーゼは相補的な粘着末端と平滑末端を連結することができるが、平滑末端の連結は非効率的であり、粘着末端の連結よりもDNAとDNAリガーゼの両方の濃度を高くする必要がある。^[6]このため、DNAクローニングに使用されるほとんどの制限酵素は、粘着末端を作成するためにDNA鎖を交互に切断する。

DNA断片をクローニングする鍵は、それを宿主細胞内で複製できるベクターDNA分子にリンクさせることです。単一の組み換えDNA分子（ベクターと挿入されたDNA断片で構成）を宿主細胞に導入すると、挿入されたDNAはベクターとともに複製され、多数の同一のDNA分子が生成されます。^[7] この基本的なスキームは次のように要約できます。

ベクター + DNA フラグメント

↓

組み換えDNA

↓

宿主細胞内での組み換えDNAの複製

↓

精製されたDNA断片の分離、配列決定、および操作

この計画には数多くの実験的バリエーションがありますが、これらのステップは実験室でのDNAクローニングに不可欠です。^[8]

アポトーシスとは、特定の形態のプログラム細胞死による細胞の死を指し、明確に定義された一連の形態変化を特徴とします。^[10]細胞と核の収縮、クロマチンの凝縮と断片化、アポトーシス小体の形成、および隣接細胞による貪食は、アポトーシスのプロセスにおける主な形態変化を特徴とします。^[11]アポトーシス中の広範な形態学的および生化学的変化により、死にゆく細胞が隣接細胞や組織に与える影響が最小限に抑えられます。

細胞死の制御に関与する遺伝子は、3つの異なる機能を持つタンパク質をコードしている：^[12]

• 細胞がアポトーシスプロセスを開始するには「キラー」タンパク質が必要である
• 「破壊」タンパク質は死にゆく細胞内のDNAを消化するなどの働きをする。
• 「貪食」タンパク質は、死にゆく細胞を別の細胞が貪食するために必要である。

染色体 DNA が小さな断片に切断される過程は、アポトーシスの不可欠な部分であり、生化学的特徴である。アポトーシスではエンドヌクレアーゼが活性化され、続いてクロマチン DNA が 180 塩基対または 180 塩基対の倍数 (360、540 など) の断片に切断される。この断片化パターンは、ゲル電気泳動によるDNA ラダーアッセイ、TUNEL アッセイ、またはNicoletti アッセイなどのテストでアポトーシスを検出するために使用できる。^{[13]アポトーシスによる DNA の断片化は}、カスパーゼ活性化 DNase (CAD) と呼ばれる酵素に依存している。^[14] CAD は通常、細胞内のカスパーゼ活性化 DNase 阻害剤 (ICAD) と呼ばれる別のタンパク質によって阻害される。^[15]アポトーシスが始まるには、カスパーゼ 3と呼ばれる酵素がICAD を切断して CAD が活性化される。 CADはその後、クロマチン中に180塩基対間隔で存在するヌクレオソーム間のDNAを切断する。ヌクレオソーム間の部位は、CADに露出されアクセス可能な唯一のDNA部分である。^[16]

DNA の断片化は、いくつかの異なる細胞タイプにおいて、特定の条件下で発生することがあります。これにより、細胞に問題が発生する場合もあれば、細胞がアポトーシスを起こすための信号を受け取る場合もあります。以下は、細胞で発生する可能性のある不規則な断片化の例です。

1. 赤血球の断片化

断片化した赤血球は破砕赤血球として知られ、一般的には赤血球の細胞内機械的損傷の結果である。^[17]多種多様な破砕赤血球が観察される可能性がある。破砕赤血球は通常比較的少数で見られ、通常は滑らかな内皮層、すなわち内皮が粗面化または不規則になっている、および/または血管腔がフィブリン繊維で交差している状態に関連している。^{[18]破砕赤血球は}溶血性貧血の患者によく見られる。破砕赤血球は進行した鉄欠乏性貧血の特徴でもあるが、この場合観察される断片化は、これらの条件下で生成された細胞の脆弱性の結果である可能性が高い。

2. 精子細胞のDNA断片化

平均的な男性の場合、精子細胞の4％未満に断片化されたDNAが含まれます。しかし、喫煙などの行動をすると、精子細胞のDNA断片化が大幅に増加する可能性があります。DNA断片化の割合と精子の運動性、形態、濃度の間には負の相関関係があります。断片化されたDNAを含む精子の割合と受精率および胚分割率の間にも負の相関関係があります。^[19]