ルリア＝デルブリュック実験

ルリア＝デルブリュック実験（1943年）（変動テストとも呼ばれる）は、細菌において遺伝子変異は選択圧への反応ではなく、選択圧がない状況下で発生することを実証した。この実験により、ダーウィンの自然選択説は、より複雑な生物だけでなく細菌にも当てはまることが結論づけられた。マックス・デルブリュックとサルバドール・ルリアは、この研究成果の一部により、 1969年のノーベル生理学・医学賞を受賞した。

栄養豊富な培地に単一の細菌を導入し、培養すると、${\displaystyle N\times }$倍加時間については、$2N$子孫を培養します。次に、バクテリオファージによる攻撃を加えます。これにより、ほとんどの細菌は死滅しますが、一部は生き残ります。その後、培養液を新しい培養液に塗り広げ、コロニーの数を数えることで、生き残った細菌の数を判断できます。

ラマルク説では、各細菌は単独でこの試練に立ち向かう。ほとんどは死滅するが、ごく少数の細菌が生き残り、新たなコロニーを形成する。一方、ダーウィン説では、ファージに対する耐性は複製中にランダムに発生する。耐性を受け継いだ細菌は生き残り、受け継がなかった細菌は死滅する。

ラマルク的シナリオでは、各細菌が等しく小さな生存確率を持つと仮定すると、新しいコロニーの数はポアソン分布に従い、生存個体数が多い場合は指数関数的に減少する。

ダーウィンのシナリオでは、突然変異の確率が十分に小さく、複製フェーズ全体で1つの突然変異しか起こらないと仮定し、さらに単純化のために実際に1つの突然変異しか起こらないと仮定すると、確率は${\displaystyle 1/2}$生存者は1人だけで、確率は${\displaystyle 1/4}$生存者は2人など。つまり、確率は次のようにスケールします。$生存者数$。

特に、生存個体数の分布が指数関数的ではなくべき乗則のように減少することが判明した場合、統計的に高い確率でダーウィン的シナリオが正しいと結論付けることができます。これは、ルリア＝デルブリュック実験の概略です。（第4.4節^{[ 1 ]}）

1940年代までに、遺伝と突然変異の概念は一般的に受け入れられていましたが、DNAが遺伝物質であるという役割はまだ確立されていませんでした。細菌は何らかの点で異なり、置かれた状況に応じて遺伝可能な遺伝子突然変異を起こす可能性があると考えられていました。つまり、細菌の突然変異は適応前（既存の）なのか、適応後（方向性のある適応）なのか、という問題でした。^{[ 2 ]}

ルリアとデルブリュックは実験で、少数の細菌（大腸菌）を別々の培養チューブに接種した。一定期間培養した後、これらの別々の培養液を等量ずつ、T1ファージ（ウイルス）を含む寒天培地に塗布した。細菌のウイルスに対する耐性が細菌の誘導活性化によって引き起こされる場合、つまり耐性が遺伝可能な遺伝的要素によるものでない場合、各プレートにはほぼ同じ数の耐性コロニーが含まれるはずである。ルリアは、突然変異率が一定であると仮定し、突然変異が選択因子への曝露後に発生し、その反応として起こる場合、生存者の数は平均が分散に等しいポアソン分布に従って分布すると仮説を立てた。デルブリュックとルリアが発見したのはこれとは違った。代わりに、各プレート上の耐性コロニーの数は大きく異なり、分散は平均よりもかなり大きかった。

ルリアとデルブリュックは、これらの結果は、初期培養チューブで増殖する各世代の細菌において一定の割合でランダムな突然変異が発生することによって説明できると提唱した。これらの仮定に基づいて、デルブリュックは、実験的に得られた値と一致するモーメント間の関係を示す確率分布（現在ではルリア・デルブリュック分布^{[ 3 ] [ 4 ]}と呼ばれている）を導出した。したがって、細菌における突然変異は、他の生物と同様に、方向性のあるものではなくランダムであるという結論に至った。^{[ 5 ]}

ルリアとデルブリュックの結果は、ニューカムによってより視覚的ではあるものの定量的ではない方法で確認された。ニューカムは細菌をペトリ皿で数時間培養した後、ファージで処理した2枚の新しいペトリ皿にレプリカプレーティングした。最初の皿は広げずにそのままにしておき、2枚目の皿は再播種した。つまり、細菌細胞を移動させて、一部のコロニー内の単一細胞が独自の新しいコロニーを形成できるようにした。コロニーがファージウイルスと接触する前に耐性細菌細胞を含んでいた場合、これらの細胞の一部が再播種した皿上で新しい耐性コロニーを形成し、そこで生存する細菌の数が多くなると予想される。両方の皿を培養して増殖させたところ、実際には再播種した皿上で最大50倍もの細菌コロニーが存在していた。これは、ウイルス耐性に対する細菌の突然変異が最初の培養中にランダムに発生したことを示している。ここでも、突然変異は選択が適用される前に発生した。^{[ 6 ]}

さらに最近では、ルリアとデルブリュックの研究結果は、環境ストレスの一形態として糖代謝の突然変異を研究したケアンズらによって疑問視された。 ^{[ 7 ]}一部の科学者は、この結果は遺伝子増幅の選択、および/または分裂できない細胞における高い突然変異率によって引き起こされた可能性があると示唆している。^{[ 8 ]}他の研究者は研究を擁護し、適応突然変異と一致する観察された現象を説明するメカニズムを提案している。^{[ 9 ]}

この分布は、最初にハルデインによって決定されたようです。^{[ 10 ]} 1991年にユニバーシティ・カレッジ・ロンドンで、この分布を記述した未発表の原稿が発見されました。導出方法は異なりますが、コンピュータを使用せずに結果を計算するのは困難です。

少数の細胞を用いて、非選択培地で並行培養を行う。^{[ 11 ]}細胞密度が均一になるように、培養を飽和状態まで行う。細胞を選択培地に播種して、変異体数（r）を求める。希釈液をリッチ培地に播種して、生存細胞の総数（Nt）を算出する。飽和培養で出現する変異体の数は、突然変異率と培養の増殖中に突然変異体が発生する時期の両方を示す指標となる。培養の増殖初期に出現する突然変異体は、増殖後期に出現する突然変異体よりもはるかに多くの突然変異体を増殖させる。これらの要因により、突然変異イベント数（m）が同じであっても、頻度（_r /Nt）は大きく変動する。頻度は突然変異_の十分な精度を示す指標ではないため、突然変異率（m / Nt ）_を常に算出する必要がある。

突然変異率（μ）の推定は複雑である。ルリアとデルブリュックはこのパラメータを分布の平均値から推定したが、この推定値は後に偏りがあることが示された。

リー・コールソン法による中央値の算出は1949年に導入された。^{[ 12 ]}この方法は以下の式に基づいている。

${\displaystyle {\frac {r}{m}}-\ln(m)-1.24=0.}$

どこ：

r = 指示薬（例：リファンピシン、塩素酸ナトリウム、ストレプトマイシン）を含む1枚のプレート上のコロニー数の中央値

m = 変化する変数で、突然変異/培養に対応する

変数mの値は、方程式の合計値が0に近づくまで調整されます。その後、突然変異率（突然変異/細胞/分裂または世代の確率）は、次の3つの式のいずれかで計算できます。

（１）${\displaystyle \mu =m/{\operatorname {median} (N_{t})}}$

（２）${\displaystyle \mu =m/(2\operatorname {median} (N_{t}))}$

（３）${\displaystyle \mu =m\ln(2)/{\operatorname {median} (N_{t})}}$

ここで、N _t は非指示培地（多くの場合、添加剤を含まないLB寒天培地）上の生存細胞数の中央値である。

どの式を使用するかの選択は、細胞分裂のどの段階で突然変異が起こると予想されるかによって決まります。^{[ 13 ]}

この方法はその後改良されましたが、これらのより正確な方法は複雑です。Ma–Sandri–Sarkar最尤推定法は現在最もよく知られている推定法です。^{[ 14 ]}実験データからの追加の方法と推定がいくつか説明されています。^{[ 15 ]}

突然変異率を計算するための 2 つの Web アプリケーションが無料で利用可能です。Falcor ^{[ 11 ]}とbz-rates です。bz-rates は、変異細胞と野生型細胞間の相対的な成長率の差を考慮できる Ma–Sandri–Sarkar最尤推定量の一般化バージョンと、突然変異率と成長率の差の両方を推定できる生成関数推定量を実装しています。具体的な例は、Jonesらによるこの論文^{[ 16 ]}に示されています。

これらのモデルすべてにおいて、突然変異率（μ）と成長率（β）は一定であると仮定した。このモデルは、これらの制約やその他の制約を緩和するように容易に一般化できる。^{[ 17 ]}これらの速度は、非実験的な設定では異なる可能性がある。また、モデルでは、N _t μ >> 1 という条件も必要となる。ここで、N _tは生物の総数である。この仮定は、ほとんどの現実的な設定または実験的な設定で成り立つ可能性が高い。

ルリアとデルブリュック^{[ 5 ]}は、次の式から突然変異率（単位時間あたりの細菌あたりの突然変異数）を推定した。

${\displaystyle \mu ={\frac {\beta \ln(\rho )}{n_{0}[1-\exp(\beta t)]}}}$

ここで、_{βは細胞増殖速度、n0}は各培養における初期細菌数、tは時間であり、

${\displaystyle \rho ={\frac {N_{s}}{N}}}$

ここで、N _sは耐性菌を含まない培養物の数であり、Nは培養物の総数である。

LeaとCoulsonのモデル^{[ 12 ]}は、独立したYule過程（フィルタリングされたポアソン過程）の集合を考慮した点で、元のモデルとは異なっていた。これらの2つのモデルを現実的なパラメータ値で数値的に比較した結果、両者の違いはわずかであることが示された^{[ 18 ]} 。このモデルの生成関数は、1978年にBartlettによって発見され^{[ 19 ]}、

${\displaystyle G(z,\mu ,\varphi )=\exp \left({\frac {\mu }{\varphi }}\left({\frac {1}{z}}-1\right)\log \left(1-\varphi z\right)\right)}$

ここで、μは突然変異率（一定と仮定）、φ = 1 − e ^{− βt}（βは細胞増殖率（これも一定と仮定）、tは時間）である。

この方程式からμを決定することは困難であることが判明しましたが、2005年に解決策が発見されました。母関数をμに関して微分することで、ニュートン・ラフソン法を適用することができ、スコア関数を使用することでμの信頼区間を得ることができます。 

ファージ T1 に対する耐性のメカニズムは、T1 受容体として機能する膜タンパク質であるfhu A 遺伝子の変異によるものと考えられています。 ^{[ 20 ]} ton B 遺伝子産物も T1 による感染に必要です。FhuA タンパク質は、フェリクロム、アルボマイシン、リファマイシンの輸送に積極的に関与しています。^{[ 21 ]}また、マイクロシン J25およびコリシン Mに対する感受性を付与し、T1 だけでなくファージ T5 および phi80 の受容体としても機能します。

FhuAタンパク質は、球状のコルクドメイン（1～160番目の残基）によって閉じられたβバレルドメイン（161～714番目の残基）を持つ。^{[ 22 ]}コルクドメイン内にはTonB結合領域（7～11番目の残基）がある。大きな膜貫通モノマーβバレルドメインは、長さが変化する22本のβストランドを持ち、そのうちのいくつかは膜の疎水性コアを大きく超えて細胞外空間に伸びている。L1からL11までの番号が付けられた11個の細胞外ループがある。L4ループはT1ファージが結合する場所である。

• 突然変異実験室にて
• 突然変異の本質：細菌遺伝学の遺産
• 科学者のプロフィール：サルバドール・E・ルリア論文 国立医学図書館によるサルバドール・ルリアに関する情報