外胚葉の分化

最初にアフリカツメガエル胚で同定されたタンパク質エクトデルミンは、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）およびTGFβスーパーファミリーのメンバーである骨形成タンパク質（BMP）のシグナル伝達を介して外胚葉の運命を促進し、中胚葉の形成を抑制します。 ^{[ 6 ]} TGFβリガンドがTGFβ受容体に結合すると、シグナル伝達因子R-Smad（Smad2、Smad3）が活性化されます。Smad4は活性化されたR-Smadと複合体を形成し、TGFβシグナルに応答して特定の遺伝子の転写を活性化します。BMP経路は同様の方法でシグナルを伝達しますが、他のタイプのR-Smad（Smad1、Smad5、Smad8）を介しています。転写因子Smad4は、TGFβ経路とBMP経路の両方で共有される唯一の共通メディエーターです。^{[ 7 ]}外胚葉の分化過程において、Smad4 の機能は、それぞれエクトデルミンと FAM によって行われるユビキチン化と脱ユビキチン化によって制御される。Smad4 のユビキチン化状態によって、TGFβ および BMP 由来のシグナルに応答できるかどうかが決まる。^{[ 6 ] [ 8 ]}胚葉形成に必要な遺伝子の発現を調節するためには、TGFβ および BMP トランスデューサー、Smad4、FAM、およびエクトデルミンの活性、局在、およびタイミングの平衡が達成されなければならない。

カエル胚の胞胚期のcDNAライブラリーをRNA発現プラスミドにクローニングして合成mRNAを生成した。次に、このmRNAを4細胞期の複数のアフリカツメガエル胚に注入し、初期胞胚胚において外胚葉マーカーSox2の領域の拡大と中​​胚葉マーカーXbraの発現の減少を調べた。胚に注入した際にこの表現型を示した50個のクローンのうちの1つがエクトデルミンであった。^{[ 6 ]} FAMの同定は、TGFβに対する応答を調節する脱ユビキチン化酵素を見つけるためのsiRNAスクリーニングによって行われた。

エクトデルミンmRNAは、母性由来で卵の動物極に沈着する。胚の初期胞胚期には、エクトデルミンmRNAとタンパク質は、動物極（最高濃度）から辺縁帯（最低濃度）へと濃度勾配を形成し、植物極由来の中胚葉を誘導するTGFβおよびノダルシグナルを抑制する。エクトデルミンmRNAは胚の背側に豊富に存在し、この段階の終わりには発現が徐々に消失する。^{[ 6 ]} Smad4は核内でエクトデルミンによってユビキチン化され、細胞質に輸送され、そこでFAMによって脱ユビキチン化される。このようにしてSmad4はリサイクルされ、再び機能することができる。アフリカツメガエルの初期胚ではFAMの発現プロファイルは確認されていないが、ゼブラフィッシュでは、FAMホモログは2細胞期に普遍的に発現しているが、発生が進むにつれて頭部中枢神経系でのみ発現するようになる。^{[ 9 ]}

エクトデルミンは、リジン519のユビキチン化によるSmad4の阻害、およびリン酸化Smad2への直接結合によってTGFβおよびBMPシグナル伝達経路を阻害するユビキチンE3リガーゼである。^{[ 6 ] [ 8 ]}辺縁帯へのEcto mRNAの注入は、初期外胚葉マーカーSox2の拡大と中​​胚葉マーカー（Xbra、Eomes、Vent-1、Mix-1、Mixer）の減少につながる。モルフォリノ戦略を用いたエクトデルミンのノックダウン実験では、これとは逆のことが起こり、胚はアクチビン応答に対してより敏感になり、中胚葉特異的遺伝子の発現の増加と拡大を示し、神経板および表皮マーカー（それぞれSox2およびサイトケラチン）の発現が下方制御される。エクトデルミンのRINGフィンガー依存性ユビキチンリガーゼ活性に一致して、エクトRINGフィンガー変異体（C97A/C100A）は機能獲得において不活性である。^{[ 6 ]} FAMの機能獲得はBMPおよびTGFβからの応答を増加させ、その活性に重要な残基の変異による機能喪失はTGFβ応答の阻害を引き起こした。

ヒト外胚葉がSmad4の負の調節因子として作用するという分子機能は、この特定の機能が脊椎動物系統間で保存されていることを示唆している。^{[ 6 ]} FAMホモログ間の配列同一性は、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、マウス、ヒトのホモログを比較すると90%以上であり、これも他の生物間で保存されている可能性があることを示唆している。 ^{[ 9 ]}実際、マウス胚におけるノックアウト遺伝子不活性化により、TGF-βシグナル伝達の阻害因子としての外胚葉の機能が保存されていることが示された。^{[ 10 ]}外胚葉を欠損した胚は、マウス胚でTGF-βシグナルによって最初に誘導される組織である前部内臓内胚葉（AVE）の発達に欠陥を示し、阻害因子の喪失と一致して、外胚葉-/-胚ではAVE誘導の拡大が見られた。 AVEは分泌型TGF-β拮抗物質の天然源であるため、この一次的なAVEの拡大は、後の段階で二次的に細胞外TGF-βリガンドの阻害を引き起こし、中胚葉の発達を欠く胚を生じさせた。このモデルは、胚の主要なTGF-βリガンドであるNodalの遺伝子量を減らすことで、ectodermin-/-胚が野生型（正常なAVE、正常な中胚葉の発達）に救済されたという発見によって確認された。TGF-β阻害因子としての役割をさらに裏付けるものとして、上胚葉（中胚葉はそこから生じるがAVEは生じない）からectoderminを組織選択的に欠失させると、AVEは影響を受けなかったが、今回は前部中胚葉の運命が拡大し、TGF-βシグナルに対する応答性の増加が示された。これらのデータは総合的に、遺伝学的手法を用いて、外胚葉がSmad4応答の阻害因子として細胞自律的な役割を果たしていることを裏付けた。この役割は、以前にアフリカツメガエル胚およびヒト細胞株で確認されていた。

アフリカツメガエルの発生初期において、転写因子FoxI1e/Xemaは表皮分化を活性化し、動物極における内胚葉および中胚葉特異的遺伝子の発現を抑制する（Suriら、2005）。FoxI1eは外胚葉が表皮と中枢神経系に分化する前に活性化すると考えられている。

Mirら（2005）は、初期胚盤胞胚の外胚葉領域において、中胚葉誘導シグナル下で植物極領域と比較して発現が低下した遺伝子を選択することにより、FoxI1e（Xema）を同定した。また、VegTを欠損した胚では、野生型と比較して動物極においてこの遺伝子の高発現が観察された。

FoxI1e mRNAは接合子期（ステージ8.5）に発現し、原腸形成初期に発現レベルが上昇し、神経胚期、尾芽期を経てオタマジャクシ初期までそのレベルを維持します。^{[ 4 ]} FoxI1eは独特なモザイク状の発現パターンを示し、最初は背側外胚葉で発現し、原腸形成が進むにつれて腹側に発現が広がり、神経板が形成されると背側での発現が抑制されます。^{[ 11 ]} FoxI1eは神経胚期にBMPシグナルに依存しており、FoxI1eの局在は外胚葉の腹側に限定されます。

FoxI1e/Xemaは、中胚葉形成、眼の発達^{[ 12 ]}、腹側頭部の分化^{[ 13 ]}に関与することが知られているフォークヘッド転写因子ファミリーのFoxI1クラスに属します。初期胚盤胞胚の植物極/中胚葉領域で発現するNotchおよび/またはNODALが、 FoxI1eの阻害因子である可能性が示唆されています^{[ 3 ] [ 11 ] 。}

スプライス阻害モルフォリノによる FoxI1e mRNA 成熟の阻害は、表皮および透過系の発生に奇形を示し、外胚葉特異的遺伝子の発現を低下させるが、FoxI1e の過剰発現は中胚葉および内胚葉の形成を阻害する。植物体構造は、通常は内胚葉および中胚葉を生じる後期胞胚塊を形成するが、FoxI1e mRNA を注入すると、外胚葉特異的マーカー (汎外胚葉性 E-カドヘリン、上皮性サイトケラチン、神経堤マーカー Slug、神経マーカー Sox-2) を発現できるが、内胚葉マーカー (エンドデルミン、Xsox17a) の発現は低下する。^{[ 3 ] [ 4 ]}

p53タンパク質は初期中胚葉遺伝子のプロモーターに結合する。^{[ 14 ]} p53は母性由来の転写産物であり、Smad2と転写因子複合体を形成し、中胚葉誘導に関与する遺伝子の発現とTGFβ標的遺伝子の活性化を促進する。^{[ 15 ]}動物極で発現する亜鉛（Zn）フィンガー核タンパク質XFDL159は、外胚葉因子として働き、p53が中胚葉分化遺伝子を活性化するのを阻害することで外胚葉を特定する。^{[ 5 ]}

ステージ11.5の動物極からcDNAライブラリーを構築し、発現ベクターにクローニングしてmRNAを生成した。次に、合成RNAを胚に注入し、これらの収集した胚の動物極を取得してアクチビン処理を行った。中胚葉マーカーXbraを抑制するクローンを選択することによってXbraを回収した。^{[ 5 ]}

XFDL156はp53と相互作用する因子であるため、このタンパク質の局在は核である（Sasai et al., 2008）。XFDL156のmRNAは母性由来であり、その後接合子で発現する。遺伝子発現のタイムラインを見ると、初期原腸形成期には発現レベルが高く、中期原腸形成期には発現が半分に減少し、ステージ20までに発現は消失する。^{[ 5 ]}

XFDRジンクフィンガーは、p53のC末端ドメインに位置する調節領域に結合し、その発現はアクチビン、FoxI1e、またはXLPOU91転写因子の存在によって影響を受けない。

モルフォリノによる機能喪失は、外胚葉領域における中胚葉分化の異常を引き起こします。これは、中胚葉マーカー（Xbra、VegT、Mix.2）の抑制解除によって引き起こされます。機能獲得は、中胚葉マーカーの発現低下を引き起こします。^{[ 5 ]}

XFDR156のヒトおよびマウスの相同体は、p53と相互作用して転写因子としての働きを阻害するというXFDRの機能を補完することができる。^{[ 5 ]}

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  アフリカツメガエル胚の初期胚盤胞における外胚葉誘導。