温度勾配ゲル電気泳動

温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）と変性勾配ゲル電気泳動（DGGE ）は、試料がアクリルアミドゲルを通過する際に、温度勾配または化学勾配を用いて試料を変性させる電気泳動法です。TGGEとDGGEは、 DNAやRNAなどの核酸、そして（あまり一般的ではありませんが）タンパク質にも適用できます。TGGEは、核酸を分離するために、温度依存的な構造変化を利用します。DGGEは、塩基配列によって決まる変性能力の違いに基づいて、同じサイズの遺伝子を分離します。DGGEは元々の手法であり、TGGEはその改良版です。

DGGEは、SUNY Albanyの教授であったLeonard Lermanによって発明されました。 ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}

同じ装置を使ってタンパク質の分析も行うことができ、これはイギリスのケンブリッジにあるMRC分子生物学研究所のトーマス・E・クレイトンによって初めて行われた。^{[ 4 ]}タンパク質と核酸は似たようなパターンを生成するが、その基本原理は全く異なる。

TGGEは、ThatcherとHodson ^{[ 5 ]}およびジョージア工科大学のRoger Wartellによって初めて記述されました。ドイツのRiesnerグループによって広範な研究が行われました。DGGE用の市販機器はBio-Rad、INGENY、CBS Scientificから入手可能で、TGGE用のシステムはBiometraから入手可能です。

DNAは負電荷を帯びているため、電場中では正極に向かって移動します。ゲルは分子メッシュであり、その穴の大きさはDNA鎖の直径とほぼ同じです。電場を印加すると、DNAはゲル中を移動し始めますが、その速度はDNA分子の長さにほぼ反比例します（DNAが短いほど速く移動します）。これが、標準的な電気泳動におけるサイズ依存分離の原理です。

TGGEでは、ゲル全体に温度勾配も存在します。室温では、DNAは二本鎖の形で安定して存在します。温度が上昇すると、鎖が分離し始め（融解）、ゲル内を移動する速度が著しく低下します。重要なのは、融解が起こる温度は配列に依存するということです（GC塩基対は、水素結合の違いではなく、スタッキング相互作用によりATよりも安定しています（シトシンとグアニンの塩基対間には3つの水素結合がありますが、アデニンとチミンの間には2つしかありません））。そのため、TGGEはDNA分子を分離するための「配列依存的かつサイズ非依存的な方法」を提供します。TGGEは分子を分離し、融解挙動と安定性に関する追加情報を提供します。^{[ 6 ]}

変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）は、変性剤を含む電気泳動ゲルに少量のDNA（またはRNA）サンプルを適用することで機能します。研究者たちは、特定の変性ゲルが様々な段階でDNAを融解させる能力があることを発見しました。この融解の結果、DNAはゲル全体に広がり、200～700塩基対という小さなものも含め、個々の成分を分析することができます。

What is unique about the DGGE technique is that as the DNA is subjected to increasingly extreme denaturing conditions, the melted strands fragment completely into single strands. The process of denaturation on a denaturing gel is very sharp: "Rather than partially melting in a continuous zipper-like manner, most fragments melt in a step-wise process. Discrete portions or domains of the fragment suddenly become single-stranded within a very narrow range of denaturing conditions" (Helms, 1990).^[7] This makes it possible to discern differences in DNA sequences or mutations of various genes: sequence differences in fragments of the same length often cause them to partially melt at different positions in the gradient and therefore "stop" at different positions in the gel. By comparing the melting behavior of the polymorphic DNA fragments side by side on denaturing gradient gels, it is possible to detect fragments that have mutations in the first melting domain (Helms, 1990). Because standard DGGE does not cover the highest-melting domain well, assays may also add a GC-rich clamp to one PCR primer to help prevent complete strand dissociation and allow detection of mutations in higher-melting domains of the fragment.^[8][9] Placing two samples side by side on the gel and allowing them to denature together, researchers can easily see even the smallest differences in two samples or fragments of DNA.

There are a number of disadvantages to this technique: "Chemical gradients such as those used in DGGE are not as reproducible, are difficult to establish and often do not completely resolve heteroduplexes" (Westburg, 2001). These problems are addressed by TGGE, which uses a temperature, rather than chemical, gradient to denature the sample.

TGGE で核酸を分離するには、ゲルを準備して流し込み、電気泳動、染色、DNA の溶出という手順を実行する必要があります。緩衝系を選択する必要があるため、温度上昇の状況下でシステムが安定していることが重要です。そのため、ゲルの準備には通常尿素が使用されますが、研究者は使用する尿素の量が DNA を分離するために必要な全体の温度に影響することを認識する必要があります。^{[ 6 ]}ゲルをロードし、実行しているゲルの種類 (平行または垂直) に従ってサンプルをゲル上に置き、電圧を調整してサンプルを実行させることができます。^{[ 6 ]}実行する TGGE の種類 (垂直または平行)に応じて、準備してロードする必要があるサンプルの量も異なります。垂直 TGGE では 1 つのサンプルを多く使用し、平行 TGGE では多くのサンプルを少量使用します。ゲルを実行したら、結果を視覚化するためにゲルを染色する必要があります。この目的に使用できる染色剤はいくつかありますが、銀染色が最も効果的なツールであることが証明されています。^{[ 6 ]} DNAは銀染色から溶出され、PCR増幅によってさらに分析することができます。^{[ 6 ]}

TGGEとDGGEは、生物医学および生態学研究において幅広く有用であり、以下にその代表的な応用例を説明する。

• Charles J. Sailey, M.D., M.S. Parts taken from a summary paper entitled "TGGE." 2003. The University of the Sciences in Philadelphia.