トポイソメラーゼ

DNAトポイソメラーゼ（またはトポイソメラーゼ）は、 DNAの位相的状態の変化を触媒し、弛緩した形態と超らせん形態、連結（カテネート）された種と連結されていない種、結び目のあるDNAと結び目のないDNAを相互変換する酵素である。^{[1] [2]} DNAの位相的問題は、その二重らせん構造の絡み合った性質のために生じ、例えば、DNA複製および転写中にDNA二重鎖が過度に巻き付く可能性がある。そのまま放置すると、このねじれにより、これらのプロセスに関与するDNAまたはRNAポリメラーゼがDNAらせんに沿って進むことが最終的に停止する。2つ目の位相的課題は、複製中のDNAの連結または絡み合いによって生じる。解決されないと、複製されたDNA間の連結が細胞分裂を妨げる。DNAトポイソメラーゼは、これらのタイプの位相的問題を防ぎ、修正する。これは、DNA に結合し、DNA 鎖の片方 (タイプ I トポイソメラーゼ) または両方 (タイプ II トポイソメラーゼ) の糖リン酸骨格を切断することによって行われます。この一時的な切断により、DNA の絡まりが解かれ、これらのプロセスの最後に DNA 骨格が再び閉じられます。DNA の全体的な化学組成と接続性は変化しないため、DNA 基質と生成物は化学異性体であり、トポロジーのみが異なります。

最初の DNA トポイソメラーゼは、 1971 年にJames C. Wangによって細菌で発見され、最初は ω (オメガ) タンパク質と名付けられました。^[3]現在では大腸菌( E. coli ) トポイソメラーゼ I (トポ I) と呼ばれ、IA 型酵素ファミリーの代表です。その後、同様の活性がJames Champouxと Renato Dulbecco によって真核細胞 (ラットの肝臓) で発見されました。^[4]原因となる酵素である真核生物トポ I は、独特のメカニズムを持ち、IB 型酵素ファミリーの代表です。最初に発見された II 型トポイソメラーゼは、細菌から 1976 年に Martin Gellert と同僚によって発見されたDNA ジャイレースであり、 ^[5] Nicholas Cozzarelli と同僚によっても特徴付けられました。^[6] DNA ジャイレースは、DNA への負のスーパーコイルの導入を触媒します。この酵素は、他のすべてのタイプ II 酵素が DNA の弛緩を触媒するのに対し、この酵素だけがこの酵素です。タイプ II 酵素は、ATP 依存的で、片方だけではなく両方の DNA 鎖を一時的に切断するという点で、タイプ I とは機構的に異なります。タイプ II トポイソメラーゼは、その後、細菌ウイルスおよび真核生物から特定されました。^{[7] [8] [9]} Topo EC コードは次のとおりです。ATP 非依存 (タイプ I)、EC 5.6.2.1。ATP 依存 (タイプ II)：EC 5.6.2.2。タイプ I トポイソメラーゼの例外は、ヘリカーゼドメイン (EC 3.6.4.12) を含み、ATP 依存的に正のスーパーコイルを導入するリバースジャイレースです。したがって、これはEC 5.6.2.2として分類される唯一のタイプ I トポイソメラーゼです(表 1)。

DNAの二重らせん構造は、2本のポリヌクレオチド鎖が互いに絡み合うことで構成されており、潜在的にトポロジー上の問題が生じます。DNAトポロジーとは、2本のDNA鎖が交差することで二重らせんのねじれが変化し、スーパーコイル、結び目、カテナンなどのDNAの三次構造が生じることを意味します。^[10] DNAの二重らせん構造に伴う潜在的なトポロジー上の問題は、1953年にジェームズ・ワトソン、フランシス・クリック、ロザリンド・フランクリンによってその構造が初めて解明されてから間もなく認識され^{、[11] [12] [13]}マックス・デルブルックとジョン・ケアンズの研究によってさらに発展しました。^{[14] [15]}閉環状の二重鎖DNAは、結合数（Lk）、ねじれ（Tw）、よじれ（Wr）の3つのパラメータで説明できます（図1）。ここで、Lk は 2 本の鎖が結合している回数、Tw は DNA のらせんの回転数 (らせん軸を基準として測定)、Wr は空間内での DNA らせんの経路の巻き具合を定量化し、「スーパーコイル」と同義になることが多いです。

3 つのパラメータは次のように関係しています: Lk = Tw + Wr。これは、1959 年に Călugăreanu によって最初に得られた数学的恒等式^[16]で、Călugăreanu 定理、または Călugăreanu–White–Fuller 定理と呼ばれています。^{[17] [18]} Lk は、らせんの 1 本または両方の鎖を切断することなく変更することはできません。Tw と Wr は相互変換可能であり、溶液条件に依存します。スーパーコイル化は、非ゼロのリンク差を持つ DNA の俗語であり、より正確には特定のリンク差と呼ばれます (σ = ΔLk/Lk ⁰、ここで Lk ^{0は緩和された DNA サークルの平均リンク数)。DNA の Lk が緩和状態の Lk 0}よりも高い場合(Lk-Lk ⁰ = ΔLk、ΔLk>0)、 DNA は正のスーパーコイル化されていると言われます。これは、Tw および/または Wr が緩和された分子に比べて増加していることを意味します。逆に、分子の Lk が Lk ⁰よりも低い場合(ΔLk<0)、DNA は負のスーパーコイルになっています。

DNAのトポロジカルな変動の結果は、DNA複製中に二重鎖の鎖が分離されることで例示されます。この分離により、複製フォークの前に正のスーパーコイル（DNAの巻き過ぎまたはねじれ）が形成され、複製フォークの後ろで娘鎖（プレカテナン）が絡み合います^{[10] [19]}（図2）。正のスーパーコイルが緩和されないと、複製フォークの進行が妨げられ、娘鎖の連結が解除されないと、細胞分裂に必要なゲノムの分離が妨げられます。^[20] RNAポリメラーゼによる転写でも、転写複合体の前に正のスーパーコイル、後ろに負のスーパーコイルが生成されます（図2）。この効果は、1987 年にLeroy Liuと James Wangによって説明されたツインスーパーコイルドメインモデルとして知られています。^[21] DNA 代謝が進むためには、これらのトポロジカル摂動を解決する必要があり、細胞が効率的に複製、転写、ゲノムの分割を行って細胞分裂と活性化を可能にします。DNA の結び目は、バクテリオファージ内や組み換え反応の生成物として見られます。^[10] 一般に、DNA の結び目は有害であり、（トポイソメラーゼによって）除去する必要があります。DNA カテナンは環状分子の複製時に形成され、細胞分裂中に娘分子が適切に分離できるように、トポイソメラーゼまたはリコンビナーゼによって解決する必要があります。解決が必要な DNA トポロジーの有害な側面に加えて、有益な側面もあります。たとえば、プラスミドの複製には、起点の負のスーパーコイルが必要です。これにより、局所的な融解が促進され、複製を開始するために必要な一本鎖 DNA が露出します。同様に、細菌の主な起源oriCからの複製の開始にも負の超らせん構造が必要である。^{[22] [23]さらに、}大腸菌ゲノム の凝縮は負の超らせん構造によって部分的に達成される。

DNAトポイソメラーゼは、DNAのトポロジカル問題を解決するために進化した酵素です（表2）。^[10] DNAの片方または両方の鎖を一時的に切断することでこの問題を解決します。これにより、トポは2つのタイプに分類されています。タイプIは一時的な一本鎖切断を伴う反応を触媒し、タイプIIは一時的な二本鎖切断を伴う反応を触媒します（図3、表2）。これらの分類にはサブタイプが存在します。

これらの酵素は、DNA の一時的な一本鎖切断を介して DNA トポロジーの変化を触媒します。反応は一本鎖と二本鎖の両方の DNA 基質で発生し、「スイベル」または「鎖通過」メカニズムを介して進行します (図 3)。反応の範囲には、少なくとも一方のパートナーが一本鎖領域を持っている場合、DNA スーパーコイルの緩和、一本鎖環状構造の解離、および脱連鎖が含まれます。古細菌酵素である逆ジャイレースの場合、DNA の正のスーパーコイル化が可能です。^[24]

タイプIAはモノマーで、DNAの一本鎖セグメントに結合します。酵素のチロシンとDNAの5'-リン酸の間にチロシルリン酸結合を形成することにより、一時的な一本鎖切断を引き起こします。切断が発生するDNAセグメントは「ゲート」またはGセグメントと呼ばれ、その切断により、DNAの別のセグメントである「トランスポート」またはTセグメントが「鎖通過」プロセスで通過できるようになります。^[25] その後、Gセグメントがライゲーションされます。鎖通過が発生するには、トポIAが構造変化を起こしてDNAゲートを開き、Tセグメントの移動を可能にする必要があります。DNA緩和反応中、このプロセスによりDNAの結合数が+/-1変化します（図4）。 IA型トポイソメラーゼの例としては、原核生物のトポIとIII、真核生物のトポIIIαとIIIβ、古細菌の酵素である逆ジャイレースなどがある。好熱性古細菌にみられる逆ジャイレースは、ヘリカーゼと結合したIA型トポから成り、DNAに正のスーパーコイルを導入できる唯一の酵素として知られている。^[24]逆ジャイレースをコードする遺伝子は、好熱性細菌のいくつかのグループにも見られ、古細菌から水平遺伝子伝達によって伝達された可能性が高い。^[26]

IB型トポイソメラーゼは、酵素内のチロシンとDNA内の3'-リン酸との間のチロシルリン酸結合の形成を通じて、DNAの一時的な一本鎖切断を伴う反応を触媒する。これらの酵素は、鎖通過機構を利用するのではなく、切断された鎖を無傷の鎖の周りで「スイベル」または「制御された回転」を介して作動する。^[27] この制御された回転機構は、ワクシニアトポIで初めて説明され^{[27] [28]}、切断が再連結される前に、酵素キャビティ内の「摩擦」によって速度が制御され、無傷の鎖の周りでDNAの自由端を回転させることができる（図3）。これにより、切断および再連結イベントあたりの連結数が変化する。この機構はIA型酵素の機構とは異なり、2つの酵素グループは構造的にも進化的にも無関係である。 IB 型トポイソメラーゼの例には、ウイルスのトポ Iに加えて、真核生物の核およびミトコンドリアのトポ I が含まれますが、これらは生命の 3 つのドメインすべてで特定されています。

IC型トポイソメラーゼはIB型酵素と似たメカニズムを持っていますが、構造的に異なります。唯一の代表例は、超好熱菌Methanopyrus kandleriに見られるトポVです。^[29]

タイプ II トポイソメラーゼは、DNA の一時的な二本鎖切断を介して DNA トポロジーの変化を触媒します。反応は二本鎖 DNA 基質上で起こり、鎖通過メカニズムを介して進行します (図 5)。反応の範囲には、DNA 弛緩、DNA スーパーコイル形成、結び目の解離、および脱連鎖が含まれます。すべてのタイプ II トポイソメラーゼは DNA 弛緩を触媒できますが、細菌トポイソメラーゼの原型であるジャイレースは、負のスーパーコイルも導入できます。一般にモノマーであるタイプ I トポイソメラーゼとは対照的に、タイプ II トポイソメラーゼはホモ二量体またはヘテロ四量体です。これらは、進化論、構造論、およびメカニズムの観点から 2 つのサブタイプに分類されます。タイプ II トポの一般的な鎖通過メカニズムは、ゲートセグメント (G セグメント) と呼ばれる 1 つの DNA 二重鎖が DNA ゲートに結合することから始まります。輸送セグメント（Tセグメント）と呼ばれるもう1つの二重鎖は、ATP作動性クランプによって捕捉され、両鎖の5′ホスホチロシン結合を伴うGセグメントの一時的な切断を通過した後、Cゲートから放出され、Gセグメントが再結合されます（図5）。酵素のターンオーバーには、ATPの結合と加水分解が必要です。

タイプ IIA トポイソメラーゼは、酵素内のチロシン (各サブユニットに 1 つ) と反対側の DNA 鎖の 4 塩基ずつずれた 5'-リン酸との間のチロシルリン酸結合の形成を通じて、DNA の一時的な二本鎖切断を触媒します。鎖通過反応は分子内または分子間で起こり (図 5)、したがってそれぞれスーパーコイル化と結び目、または切断の変化が可能になります。このプロセスにより、DNA の結合数が +/-2 変化します。タイプ IIA トポイソメラーゼの例には、真核生物のトポ IIαとトポ IIβ、さらに細菌のジャイレースとトポ IV があります。DNA ジャイレースは、他のタイプ II 酵素と同じ二本鎖通過メカニズムに従いますが、DNA に負のスーパーコイルを導入する能力に関連する独自の機能を備えています。 Gセグメントは、酵素の周りに巻き付けられたはるかに長いDNA断片（> 100 bp）の一部であり、その片方の腕は二本鎖切断を通過するTセグメントを形成します（図5）。ジャイレースの場合、ATP加水分解からの自由エネルギーのかなりの量がDNAのねじれ応力に変換されます。つまり、スーパーコイル化はエネルギーを必要とするプロセスです。^[30]さらに、ATPがない場合、ジャイレースはより遅いDNA緩和反応で負のスーパーコイルを除去することができます。

タイプ IIB は、酵素内のチロシンと DNA の反対側の鎖の 5'-リン酸の間のチロシルリン酸結合の形成を通じて、一時的な二本鎖切断も触媒しますが、IIB 酵素の場合、二本鎖切断は 2 塩基ずつずれています。タイプ IIB 酵素は重要な構造上の違いを示しますが、進化的にはタイプ IIA 酵素と関連しています。これらの違いには、タンパク質の「ゲート」の 1 つ (C ゲート) が欠けていることが含まれます (図 5)。もともと古細菌で発見されましたが、真核生物、特に植物でも発見されています。例としては、トポ VI やトポ VIII などがあります。トポ VI はこのサブタイプで最も研究されている酵素であり、優先的なデカテナーゼであると考えられています。^[31]

専門家以外の人にとって、トポイソメラーゼの最も重要な側面は、抗菌化学療法と抗がん化学療法の両方における薬物標的としての役割である。トポイソメラーゼを標的とした抗菌薬と抗がん薬のいくつかは、2019年の世界保健機関の必須医薬品モデルリストに記載されている。このように注目されている理由は、その反応がDNAの一時的な切断を介して進行し、薬物結合によって安定化されると、ゲノムDNAに毒性のある一本鎖または二本鎖切断が生成され、細胞死につながる可能性があるためである。トポ標的薬の大部分はこのように作用し、酵素-DNA共有結合切断中間体を安定化する。^{[32] [33] [34]}

細菌トポIなどのI型トポは抗生物質の標的として有効ですが、^[35]現在、これらの酵素を標的とする化合物は臨床使用されていません。しかし、II型酵素であるDNAジャイレースとDNAトポイソメラーゼIVは、広く使用されているフルオロキノロン系抗生物質の標的として大きな成功を収めています（図6）。

キノロン系抗菌化合物は 1960 年代に初めて開発され、1980 年代から臨床使用されています。^[36] シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシンなどの FQ 誘導体 (図 6) は非常に効果的です。これらの化合物は、切断部位で標的 (ジャイレースまたはトポ IV) および DNA と相互作用して、DNA-タンパク質共有結合切断中間体を安定化します。具体的には、DNA に挿入して、トポイソメラーゼ反応の DNA 再結合ステップを防止します (図 5)。これは非常に効果的な阻害メカニズムであり、いくつかのトポイソメラーゼ標的抗がん剤でも使用されています。これらの目覚ましい成功にもかかわらず、FQ に対する耐性は深刻な問題です。^{[36]キナゾリンジオンやイミダゾールピラジノン[37]} などの様々な化合物も同様の作用を示し、将来的にはこれらのいくつかがFQに取って代わることが期待されている。

_{ノボビオシン、クロロビオシン、クメルマイシンA1}などのアミノクマリン（図6）は、ストレプトマイセス由来の天然物で、ジャイレースとトポIVのATPase反応を阻害します。^[37] これらは標的に対して非常に強力ですが、透過性と毒性の問題があり、FQほどの臨床的成功は得られていません。

ジャイレースのタンパク質阻害剤は数多くあり、細菌毒素CcdB、MccB17、ParEなど^{[38] [39] [40]}はFQと同様に切断複合体を安定化する。これらのタンパク質は抗菌剤としては使えないが、その作用機序は新しい抗菌化合物の開発につながる可能性がある。ジャイレースの他のタンパク質阻害剤は切断複合体を安定化させるのではなく、トポイソメラーゼによるDNA結合を阻害する。これらにはYacG ^[41]やQnrB1やMfpAなどのペンタペプチド反復タンパク質が含まれる。^{[42] [43]}これらのタンパク質阻害剤はフルオロキノロンに対する耐性も付与する。

ヒトトポIとトポII（αアイソフォームとβアイソフォームの両方）は、抗癌化学療法の標的となり得る（図7）。^{[32] [33] [44] [45] [46] [47]} これらの化合物のほとんどはFQと同様の作用、すなわちDNA-タンパク質共有結合切断複合体を安定化する作用があり、このため触媒阻害剤とは異なり、トポイソメラーゼ毒として知られるようになった。^{[33] [34] [48]いくつかのヒトトポイソメラーゼ阻害剤は}、世界保健機関の必須医薬品リストに含まれています。

カンプトテシン（図7）は、もともとカンプトテカ・アクミナタという木から抽出されたもので、ヒトのトポIを標的とし、トポテカンやイリノテカンなどの誘導体は癌化学療法で広く使用されている。^[33] カンプトテシンとその誘導体は、トポI切断複合体を安定化させ、DNAのタンパク質媒介ニックの再結合を防ぐ働きをする。これらの界面阻害剤は、ニックの入ったDNAとのスタッキング相互作用と酵素への水素結合によって安定化される。CPT誘導体は一本鎖切断複合体を安定化させるが、その後の複製機構または転写機構との衝突により、毒性のある二本鎖DNA切断が生じると考えられている。これらの化合物は、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌などの癌の治療における第一選択薬または第二選択薬として使用されている。しかし、CPT誘導体は、化学的不安定性による毒性と治療半減期の制限に関連する制約がある。新しいトポI阻害剤であるインデノイソキノリンとフルオロインデノイソキノリンはCPT誘導体の限界を克服し、現在臨床試験中です。^[49]

エトポシド（図7）とその近縁のテニポシド（VM-26）は、野生マンドレイクの根茎から得られるエピポドフィロトキシン誘導体であり、共有結合切断複合体を安定化し、切断されたDNAの再結合を防ぐことでトポIIを標的とする。^[46] これらは通常、精巣腫瘍、小細胞肺癌、白血病などの癌の治療に他の化学療法薬と併用される。エトポシド治療は、主にトポIIβに関連する特定のゲノム転座から生じる二次性白血病を引き起こす可能性がある。^[46]

ドキソルビシン（図7）とその誘導体であるダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンは、ストレプトマイセス属細菌から得られるアントラサイクリン^[48]で、ヒトのトポIIを標的とし、他のトポイソメラーゼ毒と同様に切断複合体を安定化します。ミトキサントロンは、化学的にも機能的にもアントラサイクリンに類似した合成アントラセンジオンです。^[47]アントラサイクリンは、がん治療に使用された最初のトポイソメラーゼ阻害剤であり、乳がん、リンパ腫、白血病、癌腫、肉腫、その他の腫瘍など、幅広いがんの治療に最も広く使用され、効果的な治療法の1つとなっています。^[47] これらの化合物はDNA挿入剤であるため、トポIIを特異的に毒化するだけでなく、細胞のDNAプロセスの広範囲に影響を与える可能性があります。^[33] さらなる細胞毒性は、活性酸素種を生成するアントラサイクリンが関与する酸化還元反応に起因します。活性酸素の生成とトポIIβの中毒は、アントラサイクリンの用量制限心毒性をもたらします。^[33]

メルバロンはチオバルビツール酸誘導体であり、デクスラゾキサン（ICRF-187）は、いくつかの関連ビスジオキソピペラジン誘導体の1つであり（図7）、トポIIの触媒阻害剤の例である。すなわち、これらはトポIIの触媒サイクルの完了を阻害するが、DNA切断複合体を安定化しない。これらの触媒阻害剤は細胞毒性を示し、臨床試験でテストされているが、現在、癌治療の臨床使用には使用されていない。^[47]しかし、トポIIによるATP加水分解を阻害するデクスラゾキサンは、アントラサイクリンに関連する心毒性を予防するために使用されている。^{[50] [51]}

少なくとも 1 つのトポイソメラーゼ、DNA トポイソメラーゼ II ベータ (トポ IIβ) は、遺伝子転写において調節的な役割を果たしています。トポ IIβ 依存性の二本鎖 DNA 切断と DNA 損傷修復機構の構成要素は、前初期遺伝子の急速な発現、およびシグナル応答性遺伝子調節に重要です。^{[52] [53] [ 54] [55]}トポ IIβ は、他の関連酵素^[54]とともに、高度に転写された遺伝子または長い遺伝子で一時停止した RNA ポリメラーゼの解放に重要であると思われます。^{[56] [57] [58]}

刺激によって誘発される DNA 二本鎖切断 (DSB) は、シグナル制御遺伝子のプロモーター領域でトポ IIβ によって誘発され、短時間 (10 分から 2 時間) に限定されます。これらの DSB により、多くのシステムでこのようなシグナル応答遺伝子の発現が急速に上昇します (下の表を参照)。これらのシグナル制御遺伝子には、 エストロゲン、血清、インスリン、グルココルチコイド (デキサメタゾンなど) による刺激やニューロンの活性化に反応して活性化される遺伝子が含まれます。誘発された DNA 二本鎖切断が修復されると、シグナル応答遺伝子の転写は低い基礎レベルに戻ります。^[52]

Topo IIβとPARP-1は、シグナル応答遺伝子のプロモーターの転写開始部位の近くに中程度のレベルで恒常的に存在することがわかった。シグナル発生後、topo IIβは二本鎖切断を引き起こし、PARP-1は転写を促進できるHMGB1 / HMGA2によるヒストンH1の置換に関与した。 ^[55] Topo IIβとPARP-1は二本鎖切断部位で増加し、 DNA-PKcs、Ku70/Ku80、DNAリガーゼIVなどの非相同末端結合DNA修復経路の構成要素がtopo IIβとPARP-1と会合した。この会合はすべて、遺伝子のプロモーター領域にある単一のヌクレオソームに隣接するリンカーDNAに存在していた（図を参照）。ヌクレオソームは遺伝子の転写開始部位に近かった。^[55] 非相同末端結合DNA修復経路の構成要素はDNA二重鎖切断の閉鎖に必須であった。^[52]

RNAポリメラーゼIIは、遺伝子の転写開始部位から約30～60ヌクレオチド下流に一時停止部位を持つことが多い。^{[64] [65]} これらの部位でのRNAポリメラーゼIIの一時停止と一時停止の制御解除は、遺伝子転写において調節的役割を果たしていると考えられている。Singhらが指摘しているように、^[58]「HeLa細胞で高度に発現している遺伝子の約80％が一時停止している」。非常に短期間だがすぐには修復されないトポIIβ誘導性DNA二本鎖切断がRNAポリメラーゼII一時停止部位で発生し、一時停止状態の効率的な解除と遺伝子転写への進行に必要であると思われる。^{[56] [57] [58]} それが起こる遺伝子にとって、TOP2Bによって誘導されるDNA二本鎖切断は、遺伝子発現の調節プロセスの一部であると考えられている。

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• トポイソメラーゼIIIα
• トポイソメラーゼIIIβ

• Wang JC (2009)。二重らせんの解読: DNA の絡み合いと DNA トポイソメラーゼの作用。コールド スプリング ハーバー: コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス。p. 245。ISBN 978-0-87969-879-9。

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• 米国国立医学図書館医学件名標目表(MeSH)の DNA+トポイソメラーゼ