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化学において、クロスオーバー実験とは、化学反応のメカニズムを研究するために用いられる手法である。クロスオーバー実験では、類似しているが区別可能な2つの反応物が、同一の反応混合物中で同時に反応する。生成物は、2つの反応物のうち一方に直接対応するもの（非クロスオーバー生成物）か、両方の反応物の成分を含むもの（クロスオーバー生成物）のいずれかとなる。クロスオーバー実験の目的は、反応過程において、各反応物の成分が互いに交換される段階が存在するかどうかを判断することである。
クロスオーバー実験の結果は分析が容易な場合が多く、機構研究において最も有用で頻繁に用いられる方法の一つとなっています。有機化学では、クロスオーバー実験は分子内反応と分子間反応を区別するために最もよく用いられます。 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]無機化学者や有機金属化学者は、提案された機構の支持または反証のために、クロスオーバー実験、特に同位体標識実験に大きく依存しています。[ 4 ] 研究対象の機構が分子内または分子間置換や転位よりも複雑な場合、クロスオーバー実験の設計自体が困難な問題となることがあります。[ 5 ]適切に設計されたクロスオーバー実験は、そうでなければ不可能な機構に関する結論を導き出すことができます。多くの機構研究では、クロスオーバー実験と速度および速度論的同位体効果の測定の両方が行われます。
クロスオーバー実験は、反応機構の実験的研究を可能にする。機構研究は、立体化学的結果の予測、反応速度と選択性のための反応条件の最適化、ターンオーバー数、堅牢性などを向上させるための改良触媒の設計など、さまざまな理由から理論化学者と実験化学者にとって興味深いものである。 [ 6 ] [ 7 ]機構は反応物または生成物のみに基づいて直接観察または決定することはできないため、機構を実験的に研究することは困難である。クロスオーバー実験、速度論的同位体効果の研究、置換基による速度変化など、反応の機構に関する情報を提供できる実験方法はごくわずかである。クロスオーバー実験は、概念的に単純で、設計、実行、解釈が比較的容易であるという利点がある。現代の機構研究では、クロスオーバー実験とKIE研究は、計算方法と組み合わせてよく使用される。[ 8 ]
クロスオーバー実験の根底にある概念は基本的なものです。選択された標識方法が反応の進行に影響を与えない限り、生成物で観察される標識の変化は反応機構に起因すると考えられます。したがって、クロスオーバー実験設計における最も重要な制約は、標識が反応機構自体に影響を与えないことです。[ 1 ]
クロスオーバー実験で反応物に加えた変更が、反応の進行メカニズムに影響を与えるかどうかを知ることは難しい場合があります。クロスオーバー実験の目的は、このような予測を可能にするメカニズムについての洞察を提供することであるため、これは特に当てはまります。ラベルが反応の経路を変える可能性は常にあります。[ 1 ]
実際には、クロスオーバー実験では、研究対象の反応の通常の条件とクロスオーバー実験の条件との間の変化を最小限に抑えることを目指します。この原則は同位体標識を有利にします。なぜなら、分子内の1つの原子の同位体を変更することは、反応において容易に実行および追跡できる最小の変化だからです。同位体が反応機構に直接関与する位置に分子内に配置された場合、速度論的同位体効果が期待されます。これは、クロスオーバー実験とは独立して、またはクロスオーバー実験と並行して、機構の側面を研究するために使用できます。[ 1 ] [ 2 ] [ 8 ]速度論的同位体効果は、反応機構自体の変化ではなく、同位体の変化に基づく反応速度の変化であるため、同位体標識は一般的に有効なクロスオーバー実験の要件を満たします。同位体標識を使用しないクロスオーバー実験では、反応の提案された機構に関与しない位置にメチル置換基を追加または削除することで、有効なクロスオーバー実験が得られると通常期待されます。[ 1 ]
クロスオーバー実験を設計する際、まず最初に行うべきことは、研究対象となる反応の考えられる反応機構を提案することです。これらの考えられる反応機構に基づいて、研究者が2つ以上の可能性のある反応機構を区別できるような、従来型のクロスオーバー実験または同位体スクランブリング実験を決定することが目標となります。多くの場合、提案されたすべての反応機構を支持または否定するために、多くの反応機構研究手法を用いる必要があります。しかし、分子内反応機構と分子間反応機構といった有機反応機構の区別など、場合によってはクロスオーバー実験だけで主要な可能性を区別できることもあります。
熱クライゼン転位のメカニズムはクロスオーバー実験によって研究されており、この技術の適用方法の優れた例となっている。[ 9 ]メカニズムが決定される前は、反応は分子間または分子内経路で進行する可能性があると提案されていた。[ 1 ]
これら二つの提案された反応機構を見ると、分子間反応機構と分子内反応機構の場合と同様に、クロスオーバー実験が両者を区別するのに適していることは明らかです。クロスオーバー実験設計における次のステップは、標識された反応物を提案することです。非同位体標識法の場合、系への最小限の摂動は、反応しない位置にメチル基を付加することです。
各反応機構によって生じる生成物を予測することで、与えられたクロスオーバー実験設計が対象となる反応機構を区別できるかどうかが明らかになります。これは、同位体標識を用いる場合に特に重要です。ある位置に標識を付けることで、複数の可能性のある反応機構のうち2つしか区別できない場合もありますが、別の位置に同位体標識を付けることで、3つの可能性のある反応機構を区別したり、遷移状態や中間体などに関する知見を得たりできる可能性があります。解釈上の価値が確立された後は、提案された反応物の合成が可能かどうか、また、提案された各反応機構と出発物質について予測される生成物を区別することがどれほど容易か、あるいは困難かといった、実際的な側面を考慮することが重要です。
クライゼン転位反応において、メチル基を1つ付加することによる標識化では、標識不足の系が生じる。その結果生じるクロスオーバー実験は、分子間反応機構と分子内反応機構の生成物が同一であるため、反応機構の研究には役立たない。
十分に標識されたシステムを得るには、分子間機構で分離する分子の「半分」の両方を標識する必要があります。これは二重標識システムとして知られており、一般的にクロスオーバー実験の要件です。[ 1 ]次に、各機構の生成物を予測すると、クロスオーバー生成物が非クロスオーバー生成物と異なることがわかります。これが確立され、生成物が予測されると、実験を実行して生成物を特徴付けることができます。同位体標識を使用すると、生成物はより多様になり、標識の分布はより複雑になることがよくあります。この場合、機構に応じて各位置に現れると予想される標識の相対量を明示的に予測することも重要です。
クライゼン転位のクロスオーバー実験を行うと、クロスオーバーしない生成物のみが観察される。このことから、この転位の標準的な矢印移動機構に示されているように、機構は分子内であると判断される。[ 1 ] [ 10 ]
同位体標識実験は、反応機構研究で使用される実験で、標識として同位体を用い、生成物中のこれらの標識を追跡するものです。同位体標識実験は、一般的にクロスオーバー実験の一種と考えられています。[ 1 ]しかし、同位体標識実験では、従来のクロスオーバー実験に比べて、標識方法や生成物の可能性がはるかに多くあります。同位体標識実験がクロスオーバー実験として分類されるのは、直接的な類似性ではなく、2つの実験の根底にある概念、目標、設計原理が類似していることに基づいています。同位体標識実験は、従来のクロスオーバー実験と直接類似するように設計できますが、同位体標識実験を実施する方法は他にもたくさんあります。
同位体標識実験は、反応系への摂動を最小限に抑えられるという利点がある一方で、溶媒や反応混合物中に存在する他の物質との同位体交換の可能性によって制限される。同位体標識が溶媒中の同じ原子の別の同位体と交換した場合、同位体標識実験の結果は使用できなくなる。このため、例えばプロトン性溶媒中の特定の位置における重水素標識の使用は制限される。しかし、同位体標識はこの相互作用を検出できるため、反応溶媒との相互作用を調査する際には、この交換が有用となる場合もある。
熱的クライゼン転位について同位体標識実験が行われた。末端炭素を14Cで標識すると、生成物は1つだけであり、同位体標識はベンジル位に現れる。分子間機構で予想される生成物は観察されないため、この結論は従来のクロスオーバー実験の結果と一致する。[ 1 ] [ 10 ]
クロスオーバー実験の大きな利点は、生成物を直接特性評価することで実験結果が得られることである。そのため、実験化学者にとって既に馴染みのある手法が用いられる。質量分析法とNMR分光法は、生成物とその相対比率を決定する最も一般的な方法である。NMR分光法は、水素または炭素の同位体を用いる同位体標識研究に特に有用である。
IR分光法は、金属-一酸化炭素結合へのアルキル挿入機構を調べて金属-アシル錯体を形成する際に13 COが使用されるような特殊な状況で有用である。生成物中の13 COの追跡は、 12 Cと比較して13 Cの質量が大きいためν(CO)伸縮振動数が低エネルギー側に特徴的にシフトすることから、 IR分光法を用いて行われた。 [ 4 ]
特定の反応機構から予想される生成物は、クロスオーバー実験の設計段階で決定されます。これは確立するのが非常に複雑な場合もありますが、結果の解釈を容易にします。観測された生成物が特定の反応機構によって予測されるものと一致する場合、その反応機構が実際に作用していると結論づけるのが妥当です。結果が予想される分布と一致しない場合は、別の反応機構や、標識が反応の進行に影響を与えた可能性を考慮する必要があります。
分子間反応と分子内反応を区別するために用いられるクロスオーバー実験では、クロスオーバー生成物が存在しないことは、存在する場合よりも決定的な証拠とはなりにくい。これは、溶媒ケージ効果が分子間反応機構を覆い隠している可能性があるためである。[ 1 ] [ 5 ]
クロスオーバー実験にはいくつかの限界がある。提案された反応機構を区別するのに役立つものの、既に提案されている機構以上の機構に関する洞察を提供する能力には限界がある。有用なクロスオーバー実験の設計は、生成物中の標識分布の予測の根拠となる提案された機構があることに依存する。結果が期待される結果と一致しない場合、クロスオーバー実験の結果から実際の機構は明らかにならない。さらに、クロスオーバー実験に適さないシステムもあるという限界もある。これは、標識の添加によって機構が変化したり、反応が完全に停止したりする場合、提案された機構がない場合、同位体標識が溶媒分子と交換する場合、またはクロスオーバー実験に必要な標識種を合成することが現実的でない場合などに起こり得る。
クロスオーバー実験の主な限界の1つは、溶媒ケージ効果が解離機構を覆い隠している可能性を排除できないことです。クロスオーバー生成物が観察された場合、その機構が純粋に分子内ではないという証拠は決定的です。しかし、クロスオーバー生成物がないことは、その機構が純粋に分子内であるという決定的な証拠にはなりません。反応が溶媒中で行われる限り、溶媒ケージ効果がクロスオーバー生成物の形成を妨げている可能性は常にあります。[ 1 ] [ 5 ]
分子が溶媒に溶解すると、溶媒が分子の周りに「ケージ」を作っていると考えるのが適切です。特定の分子がこの溶媒ケージから「脱出」するのにかかる時間は、分子の大きさと溶媒の分子間力の強さによって異なりますが、1 × 10⁻¹⁰秒のオーダーであると考えられています。 [ 11 ]反応が分子が溶媒ケージから脱出できるよりも速く起こると、クロスオーバーしない生成物のみが観察され、真の反応機構が隠蔽されます。[ 5 ]
反応の時間スケールが溶媒ケージ効果の時間スケールよりもはるかに遅い場合、解離した分子種は溶媒ケージから脱出し、クロスオーバー生成物を形成することができる。これは、クロスオーバー実験において分子間機構を介して起こり、予想どおりクロスオーバー生成物を形成する反応を適切に表している。
反応の時間スケールが溶媒ケージ効果の時間スケールよりも速いか、同程度の場合、これは上記と同じクロスオーバー実験をより正確に表していると言えます。解離機構または分子間機構が起こっているにもかかわらず、反応の時間スケールが十分に短いため、解離した断片は溶媒ケージ内に閉じ込められたままとなり、クロスオーバーは発生しません。
溶媒ケージがクロスオーバー実験に及ぼす影響は、純粋に理論的な概念ではありません。溶媒ケージの存在を示す最初の実験的証拠の 1 つは、クロスオーバー実験における溶媒ケージ効果の観察でした。ラジカル再結合は非ラジカル反応に比べて非常に短い時間スケールで起こるため、溶媒ケージ効果はラジカル化学に特に関連しています。[ 5 ] Lyon と Levy は、ラジカルクロスオーバー実験における溶媒ケージの効果を初めて実証しました。プロチオアゾメタンと重水素化アゾメタンを混合して気相で照射すると、結果として、予想される非クロスオーバーおよびクロスオーバーラジカル再結合生成物である C2H6 、CH3CD3、およびC2D6 が1 : 2 :1の統計的混合物になります。 [ 12 ]
しかし、同じ反応をイソオクタン溶液中で行った場合、生成されるCH 3 CD 3の量は、生成されるC 2 H 6の総量の0.3%未満になります。[ 12 ] [ 13 ]このことから、溶媒ケージ効果は、特にラジカルが関与する短時間スケールの反応において、クロスオーバー実験の結果を大きく変えることができることが示されました。
最初の環状制限試験は、1970 年にAlbert Eschenmoserによって発表されたクロスオーバー実験でした。スルホニル陰イオンが求核剤として、メチル（アレンスルホン酸）が求電子剤として作用するメチル化反応が起こることは知られていましたが、分子間または分子内のいずれかで進行する可能性があると提案されました。[ 2 ]
クロスオーバー実験でプロチオと二重標識重水素スルホニルアニオンを同時に反応させたところ、クロスオーバー生成物と非クロスオーバー生成物が 1:1:1:1 の混合物となり、反応が分子間機構で進行することが明確に示されました。この結果は、分子内機構では 6 員環に似た環状遷移状態を経て進行し、これは多くの有機反応機構で好ましい遷移状態であることが知られているため、驚くべきものでした。この反応が分子内機構ではなく分子間機構で進行するという事実は、SN2反応における求核攻撃の幾何学的構造に一定の制約があるという結論につながりました。[ 2 ] [ 14 ]立体電子的制約は、バルドウィンの規則で合理化されました。この概念は、その後の多くの環状制限テストでさらに検討されました。[ 15 ]
無機化学および有機金属化学の反応機構は複雑で、実験的に決定するのが難しい場合が多い。触媒反応機構は、前触媒以外に金属錯体を全く単離できない場合、特に研究が困難である。2013年のDalton Transactionsの特集号「機構的有機金属化学」では、ゲスト編集者のRobert H. Crabtreeが、 20世紀半ばに金属カルボニルヒドリド化学の創始者が有機金属反応機構を「化学哲学」と呼んだという逸話を語っている。[ 8 ]この特集号では、有機金属反応の現代的な機構研究の例を17個紹介している。多くの場合、クロスオーバー実験、同位体スクランブリング実験、速度論的同位体効果、計算研究が併用され、有機金属反応機構のいくつかの面を解明している。
クロスオーバー実験は無機反応機構に関する非常に有用な洞察を提供するため、重要なクロスオーバー実験には時折、通常とは異なる同位体が用いられる。EL Muetterties によるジレニウムデカカルボニルに関する研究では、レニウムカルボニル二量体の置換反応機構を決定するために185 Re と187 Re を用いたクロスオーバー実験が行われた。質量分析法を用いて、生成物中のこれらの同位体を区別した。同じ研究では、13 CO と12 CO を用いたクロスオーバー実験も行われた。[ 16 ] VV Fokin が最近行った銅(I)触媒によるアジド-アルキン環化付加反応に関する同位体クロスオーバー実験では、初期同位体分布63 Cu と65 Cu からの同位体濃縮が研究された。これらの実験の結果から、この重要なクリック反応の触媒サイクルには二核銅中間体が関与しているという結論に至った。[ 17 ]
還元的脱離は、有機金属反応機構、特に触媒サイクルにおいて一般的なステップである。CH または CC 結合を形成する触媒サイクルでは、還元的脱離はしばしば最終生成物形成ステップである。[ 18 ] 正方形平面 d 8金属錯体は、CH または CC 結合形成反応において活性触媒となることが多く、これらの種からの還元的脱離はよく理解されている。正方形平面 d 8錯体からの還元的脱離にはいくつかの既知の機構がある。解離機構では、1 つの配位子が解離し、3 配位中間体から還元的脱離が起こる。非解離機構では、正方形平面錯体自体から還元的脱離が起こる。還元的脱離を受ける配位子は互いにシスでなければならないか、そうでなければ還元的脱離する前にシスになるように再配列しなければならない。最後に、会合機構において5番目の配位子が会合し、結果として生じる四角錐型錯体上の隣接する2つの基の間で還元的脱離が起こる。[ 4 ]
具体的なメカニズムに関わらず、還元的脱離は隣接する 2 つのリガンドを結合する分子内プロセスであることは一貫して真実である。これは今では自明に思えるかもしれないが、有機金属メカニズムが最初に研究されたとき、これらの制約の証明はなかった。J . Stilleによって報告された一連のクロスオーバー実験は、還元的脱離が分子内プロセスであり、隣接していないグループは還元的に脱離しないことを示した最初の実験の 1 つです。[ 4 ] [ 19 ] [ 20 ]この研究では、それぞれ 2 つの結合したホスフィンリガンドと 2 つの結合したメチル基を持つ いくつかの正方形平面 d 8パラジウム種が使用されました。1 つの錯体、Pd(dppe)(CH 3 ) 2 は、キレートホスフィン 1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン (dppe) によってcis配座に固定されました。 2番目の錯体であるPd(transphos)(CH 3 ) 2は、剛直な芳香族リンカーを持つキレートホスフィンである「transphos」によってトランス配座に固定された。[ 19 ]
シス-メチル基を有する錯体は、還元的脱離を起こしてエタンを生成することが既に知られていた。Pd(dppe)(CH 3 ) 2と Pd(PPh 3 ) 2 (CH 3 ) 2の両方についてクロスオーバー実験を行った。どちらの場合もクロスオーバー生成物は観察されず、還元的脱離が分子内反応であることを証明した。[ 19 ]
2 つのシス配座錯体とは異なり、Pd(transphos)(CH 3 ) 2 は 100 °Cに加熱しても還元的脱離を起こさなかった。しかし、Pd(transphos)(CH 3 ) 2にヨウ化メチルを加えると、すぐにエタンが生成した。この還元的脱離も隣接する配位子のみに限定されるかどうかを調べるために、同位体標識実験を行った。唯一の生成物は、シス脱離の重水素標識生成物であった。このことから、金属錯体上で互いに隣接する配位子のみが還元的脱離を起こせるという最終的な結論に至った。[ 4 ] [ 19 ]
この研究では、反応速度データも追跡および分析し、化学プロセスについて可能な限り多くの情報を得るために、複数の戦略を協調的に採用することの価値を示しました。他の速度実験の中でも、溶媒と過剰ホスフィン配位子の濃度を変化させたときのシス-トランス異性化の反応速度を追跡しました。これらの結果を使用して、溶媒またはホスフィンの会合、それに続く擬回転、そして溶媒またはホスフィンの解離からなる、正方形平面d 8パラジウム種におけるこの異性化のメカニズムを確立しました。[ 19 ]
酵素触媒反応のメカニズムは、クロスオーバー実験を用いて研究することもできます。生化学におけるこの技術の応用例としては、ヌクレオシドジホスホヘキソース-4,6-デヒドラターゼによって触媒される反応、アコニターゼによって触媒されるクエン酸からの水の除去、補酵素B12依存性酵素によって触媒されるさまざまな反応の研究などが挙げられます。有機化学や有機金属化学における同位体標識研究では、水素の同位体が必要な場合に通常重水素が使用されますが、生化学のクロスオーバー実験ではトリチウムがよく使用されます。[ 21 ]これは、トリチウムが放射性であり、ゲル電気泳動のゲルのオートラジオグラフィーを使用して追跡できるためです。
アコニターゼの作用機序を理解するための初期の取り組みでは、同位体標識実験とクロスオーバー実験が不可欠でした。トリチウム、重水素、および18Oを使用した同位体スクランブリング実験は、IA Rose と EL O'Connell によってアコニターゼ水和酵素反応に対して行われました。[ 22 ]これらの実験結果を使用して、反応の一般的なメカニズムを構築することが可能になりました。これらの初期の実験以降、このメカニズムを改良するためのさらなる研究が行われています。[ 23 ] [ 24 ]
そのような同位体スクランブリング実験の1つは、2-メチル-シス-アコニット酸の存在下で[2 R - 3 H]クエン酸とアコニターゼとの反応でした。この反応により、非標識のシス-アコニット酸と2-メチル-[3- 3 H]イソクエン酸の両方が生成されました。この反応がこの位置でトリチウムの分子間移動を生成できることは、クエン酸から除去されたプロトンが溶媒と交換されないことを示しています。同様の実験で[2- 18 OH]イソクエン酸とアコニターゼを反応させたところ、同位体標識されたクエン酸は生成されず、除去されたプロトンとは異なり、ヒドロキシル基がターンオーバーごとに溶媒と交換されることが示されました。[ 21 ] [ 22 ]
