チアPET

ペアエンドタグシーケンシングによるクロマチン相互作用解析（ChIA-PETまたはChIA-PETS）は、クロマチン免疫沈降（ChIP）ベースの濃縮、クロマチン近接ライゲーション、ペアエンドタグ、およびハイスループットシーケンシングを組み込んで、ゲノム全体の新しい長距離クロマチン相互作用を決定する技術です。^[1]

遺伝子は、調節要素、絶縁体および境界要素、転写因子結合部位 (TFBS)など、プロモーターから離れた領域によって制御されることがあります。調節領域と遺伝子コード領域間の相互作用を明らかにすることは、健康および疾患における遺伝子調節を支配するメカニズムを理解するために不可欠です(Maston ら、2006)。ChIA-PET は、遠位および近位の調節転写因子結合部位と、それらが相互作用する遺伝子の プロモーターとの間の、ユニークで機能的なクロマチン相互作用を特定するために使用できます。

ChIA-PET は、細胞分化、増殖、発達などのプロセスにおけるゲノム制御のメカニズムを解明するためにも使用できます。DNA結合調節タンパク質とプロモーター領域のChIA-PETインタラクトームマップを作成することで、治療介入の固有のターゲットをより適切に特定できます (Fullwood & Yijun、2009)。

ChIA-PET法は、ChIPベースの方法^[2]と染色体コンフォメーションキャプチャ（3C）ベースの方法^[3]を組み合わせて、両方のアプローチの機能を拡張します。ChIPシーケンシング（ChIP-Seq）は転写因子結合部位（TFBS）を特定するために使用される一般的な方法であり、3Cは長距離クロマチン相互作用を特定するのに使用されてきました。どちらも独立して、ゲノム全体でのde novo長距離相互作用を特定する上で限界があります。ChIP-SeqはTFBSをゲノム全体で特定できますが、^{[4] [5]}染色体に沿ったタンパク質結合部位の線形情報のみを提供し（それらの間の相互作用は提供せず）、高いゲノムバックグラウンドノイズ（偽陽性）の影響を受ける可能性があります。3Cは非線形の長距離クロマチン相互作用を分析できますが、ゲノム全体で使用することはできず、ChIP-Seqと同様に、高レベルのバックグラウンドノイズの影響を受けます。ノイズは相互作用領域間の距離（最大100kb）に応じて増加するため、クロマチン相互作用の正確な特性評価には面倒で退屈なコントロールが必要です。^{[6]遺伝子座特異的な相互作用プロファイリング法である3Cとは異なり、} Hi-Cなどの代替法が確立されており、ゲノム全体で相互作用をプロファイリングできます。^[7] TFBSと長距離相互作用の両方に全ゲノムプロファイリング法がありますが、アプローチをChIA-PET法と組み合わせると、目的のタンパク質が結合しているゲノム領域と、それが相互作用するゲノム領域を特定できます。^{[8] [9]}

ChIA-PET法は、ChIP断片を超音波処理してランダムな付着物を特異的な相互作用複合体から分離することにより、ChIP-Seqで見られる非特異的相互作用ノイズの問題をうまく解決します。次の段階はエンリッチメントと呼ばれ、ゲノム全体の分析の複雑さを軽減し、事前に決定されたTF（転写因子）によって結合されたクロマチン相互作用に特異性を追加します。長距離相互作用を識別する3Cアプローチの能力は、近接ライゲーションの理論に基づいています。DNAインターライゲーションに関しては、共通のタンパク質複合体によって束縛された断片は、溶液中で自由に拡散したり、異なる複合体に固定されている断片よりも、希薄条件下でより大きな運動学的利点があります。ChIA-PETは、タンパク質複合体に束縛されたDNA断片の自由端にリンカー配列を組み込むことにより、この概念を活用します。調節複合体によって束縛された断片の接続性を構築するために、リンカー配列は核近接ライゲーション中にライゲーションされます。したがって、リンカー接続ライゲーションの産物は、超高スループットPETシーケンシングによって分析され、参照ゲノムにマッピングすることができます。ChIA-PETは、3Cや4Cのように検出に特定の部位に依存しないため、クロマチン相互作用の偏りのないゲノム全体のde novo検出が可能です。^[8] Hi-Cと比較して、抗体プルダウンを使用すると、シーケンスされたフラグメントの数が目的のタンパク質によって結合されたクロマチン相互作用に制限されるため、データ分析も容易になります。

ワークフローのウェットラボ部分:

• ホルムアルデヒドは DNA とタンパク質の複合体を架橋するために使用されます。超音波処理はクロマチンを分解し、非特異的な相互作用を減らすために使用されます。
• 選択した特定の抗体を使用して、目的のタンパク質に結合したクロマチン断片を濃縮します。抗体に結合した ChIP 材料を使用して、ChIA-PET を構築します。
• 図 1. 隣接する MmeI 部位を含むビオチン化オリゴヌクレオチド ハーフリンカーは、近接して連結された DNA フラグメントを接続するために使用されます。2 つの異なるリンカー (A および B) が、2 つのリンカー シーケンスのそれぞれに特定のヌクレオチド バーコード (CG または AT) とともに設計されています (これにより、図 5 で説明されているように、キメラ連結生成物を識別できます)。
• 図 2. リンカーは連結された DNA 断片に連結されます。
• 図 3. リンカー断片は、希釈条件下で ChIP ビーズに連結されます。精製された DNA は、MmeI によって消化され、認識部位から離れた位置で切断され、タグ - リンカー - タグ構造が放出されます。
• 図 4. ビオチン化された PET は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ上に固定されます。
• 図 5. AA (CG/CG) および BB (AT/AT) リンカー バーコード構成の PET 配列は複合体内ライゲーション産物の可能性があると考えられていますが、AB (CG/AT) リンカー構成の PET 配列は、異なるクロマチン複合体に結合した DNA 断片間のキメラライゲーション産物に由来すると考えられます。

ワークフローのドライラボ部分:

PET抽出、マッピング、統計分析

PET タグは抽出され、コンピューター内で参照ヒトゲノムにマッピングされます。

ChIP濃縮ピーク（結合部位）の同定

自己連結 PET は、参照ゲノムへの最も信頼性の高いマッピング (20 + 20 ビット/秒) を提供するため、ChIP 濃縮部位の識別に使用されます。

ChIPエンリッチメントピーク検出アルゴリズム

重複する自己連結 PET が複数ある場合、呼び出されたピークは結合部位とみなされます。偽発見率 (FDR) は、PET 由来の仮想 DNA 重複のランダムな背景と推定される背景ノイズを推定する統計シミュレーションを使用して決定されます。

反復DNAのフィルタリング（非特異的結合に影響）

構造上の大きな変異がある領域に存在するサテライト領域と結合部位は削除されます。

ChIPエンリッチメントカウント

各サイトでの自己ライゲーション PET とインターライゲーション PET (+ 250 bp ウィンドウ内) の数を報告します。特定のサイトでの自己ライゲーション PET とインターライゲーション PET の合計数は、ChIP エンリッチメント カウントと呼ばれます。

図 6. PET 分類: 一意に整列した PET 配列は、1 つの DNA 断片から派生したものか、2 つの DNA 断片から派生したものかによって分類できます。

• セルフライゲーションPET

PET の 2 つのタグが、ChIP DNA フラグメントの範囲内 (3 Kb 未満) のゲノム範囲で同じ染色体上にマッピングされ、予想される自己連結方向を持ち、同じ鎖上にある場合、それらは単一の ChIP DNA フラグメントの自己連結から派生したものとみなされ、自己連結 PET とみなされます。

• インターライゲーションPET

PET がこれらの基準に当てはまらない場合、その PET は 2 つの DNA 断片間の連結産物から生じたものである可能性が高く、連結間 PET と呼ばれます。連結間 PET の 2 つのタグは固定されたタグ方向を持たず、同じ鎖上に見つからない可能性があり、ゲノム範囲を持たない可能性があり、同じ染色体にマッピングされない可能性があります。

• 染色体内連結PET

インターライゲーション PET の 2 つのタグが同じ染色体にマッピングされているが、どの方向でも範囲が 3 Kb を超える場合、これらの PET は染色体内インターライゲーション PET と呼ばれます。

• 染色体間連結PET

異なる染色体にマッピングされた PET は、染色体間連結 PET と呼ばれます。

図 7. 遠位調節要素が標的遺伝子のプロモーター領域を含む長距離クロマチン相互作用を開始する仕組みを示す提案メカニズム。

相互作用により、アンカー センターに複数の TFBS を持つ DNA ループ構造が形成されます。小さなループはアンカー センター近くの遺伝子を密なサブコンパートメントにパッケージ化するため、制御タンパク質の局所濃度が高まり、転写活性化が促進される可能性があります。このメカニズムにより転写効率も高まり、RNA pol II が密な環状遺伝子テンプレートを循環できるようになります。大きな相互作用ループは、ループの両端にあるアンカー サイト近くの離れた遺伝子をリンクして協調制御を行う可能性が高く、長いループ内の遺伝子を分離して活性化を防ぐ可能性があります。Fullwood ら (2009) より引用。

ChIA-PET法の利点

• ChIA-PET は、長距離クロマチン相互作用解析のための偏りのない全ゲノムおよび de novo アプローチとなる可能性を秘めています (Fullwood & Yijun、2009)。
• ChIA-PET 実験では、タンパク質因子結合部位 (自己連結 PET) と結合部位間の相互作用 (相互連結 PET) の 2 つのグローバル データセットを提供できます。
• ChIA-PET では、ChIP を活用してゲノム全体の解析の複雑さを軽減し、特定の関心因子によって結合されたクロマチン相互作用に特異性を追加します。
• ChIA-PET は、Roche 454 パイロシーケンシング、Illumina GA、ABI SOLiD、Helicos などのタグベースの次世代シーケンシング手法と互換性があります。
• ChIA-PET は、転写制御やクロマチン構造形成に関与するさまざまなタンパク質因子に適用できます。
• ChIA-PET 分析は、特定の核プロセスに関与するクロマチン相互作用に適用できます。RNA ポリメラーゼ II などの一般的な因子を使用することで、転写制御に関与するすべてのクロマチン相互作用を特定できる可能性があります。さらに、DNA 複製またはクロマチン構造に関与するタンパク質因子を使用すると、DNA 複製およびクロマチン構造の変更によるすべての相互作用を特定できます (Fullwood ら、2009)。

弱点

• シスおよびトランス調節複合体には、細胞および組織の特定の条件に基づいたタンパク質のユニークな組み合わせが含まれていることが十分に確立されています (Dekker ら、2006)。単一の機能的な TFBS の識別は大きな進歩ですが、複合体内の個々のタンパク質を識別するために ChIA-PET を使用する場合、相互作用する各タンパク質を識別するために推測作業と複数の実験が必要になります。これはコストがかかり、時間のかかる作業です。
• ChIA-PET は、使用される抗体の品質、純度、特異性によって制限されます (Fullwood ら、2009)。
• ChIA-PET は、参照配列 (ref) にマッピングできる配列の識別に依存します。
• ChIA-PET では、PET 読み取りを整理して参照ゲノムにマッピングするために、ピーク呼び出しコンピュータ アルゴリズムを使用する必要があります。ソフトウェア プラットフォームによって異なるため、使用するプログラムによって結果が異なる場合があります。
• 反復 DNA 領域は遺伝子制御と関連付けられる可能性がありますが (Polak & Domany、2006)、データに影響を及ぼす可能性があるため削除する必要があります (Fullwood ら、2009)。
• 2つの地域からの同時濃縮は、周辺地域に対する偏りを生じさせる。^[10]

Fullwood ら (2009) は、ChIA-PET を使用して、ヒト癌細胞におけるエストロゲン受容体アルファ(ER-アルファ) を介したクロマチン相互作用ネットワークを検出し、マッピングしました。得られたグローバル クロマチン インタラクトーム マップでは、遠隔の ER-アルファ結合部位も長距離クロマチン相互作用を介して遺伝子プロモーターに固定されていることが明らかになりました。これは、ER-アルファが広範囲のクロマチン ループによって機能し、遺伝子をまとめて協調的な転写制御を行うことを示しています。

オリジナルのChIP法は、タンパク質を選択的に識別して結合し、クロマチンの状態と遺伝子の転写に関する情報を提供する抗体ベースの技術です。[17]

この技術は、任意の数のゲノム遺伝子座間の3次元近接性を収集することにより、3Cベースの技術に関連する多くの欠点を排除します。^[12]

SPRITEは、核内の高次相互作用をゲノム全体にマッピングする技術です。このアプローチは、より広い空間距離にわたって発生する相互作用を検出し、同時に発生する多数のRNAとDNAの相互作用をゲノム全体で検出することを可能にします。 ^[13]

ChIA-Dropは、液滴ベースおよびバーコードリンクシーケンシングを使用して、単一分子の精度で多重クロマチン相互作用を解析する簡単な方法です。Hi-CやChIA-PETなどの従来のペアワイズ集団レベルのアプローチは、この技術とは異なります。^{[14] [15]}

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• ChIA-PET ゲノム ブラウザ - このブラウザは、Fullwood ら (2009) のデータを表示するためのもので、結合部位と相互作用のマクロ画像とゲノム全体の状況を示すカスタムの全ゲノム相互作用ビューアが含まれています。