単一分子FRET

単分子蛍光（またはフェルスター）共鳴エネルギー移動（またはsmFRET）は、単一分子（通常は生体分子）内の 1～10ナノメートルスケールの距離を測定するために使用される生物物理学的 手法です。これはFRETの応用であり、一対のドナー蛍光体とアクセプター蛍光体が励起され、単一分子レベルで検出されます。多数の分子の FRET 信号を提供する「アンサンブル FRET」とは対照的に、単分子 FRET は各分子の FRET 信号を分解できます。smFRET 信号の変化は、特にシステムがアンサンブル/バルク信号の変化のない平衡状態にあるときに、アンサンブル測定では提供できない運動情報を明らかにするのに便利です。異なる分子間の不均一性も観察できます。この方法は、DNA/RNA/タンパク質の折り畳み/展開やその他の構造変化などの分子内ダイナミクス、および反応、結合、吸着、脱着などの分子間ダイナミクスの多くの測定に適用されており、化学センシング、バイオアッセイ、バイオセンシングに特に役立ちます。

単一分子のFRET測定は、通常、蛍光顕微鏡で、表面に固定された分子または自由に拡散する分子を使用して行われます。単一分子の検出を可能にするために十分な蛍光信号を生成するために、単一のFRETペアは、通常はレーザーなどの強力な光源を使用して照射されます。広視野多光子顕微鏡法は、通常、全反射蛍光顕微鏡（TIRF）と組み合わせられます。これにより、測定チャンバーの表面でFRETペアが選択的に励起され、サンプルの大部分からのノイズが除去されます。あるいは、 共焦点顕微鏡法は、蛍光光をピンホールに焦点を合わせて焦点外の光を除去することで、バックグラウンドを最小限に抑えます。 ^[1]共焦点ボリュームの直径は約220 nmであるため、サンプルの画像が必要な場合は、それをスキャンする必要があります。共焦点励起を使用すると、TIRFを使用する場合よりもサンプルのはるかに深いところまで測定できます。蛍光信号は、広視野顕微鏡用の超高感度CCDまたは科学用CMOSカメラ、または共焦点顕微鏡用のSPADを使用して検出されます。 ^[2]単一分子の強度対時間が得られれば、FRET効率を各FRETペアについて時間の関数として計算することができ、それによって単一分子スケールで運動イベントを追跡し、各分子の状態分布を示すFRETヒストグラムを作成することができます。ただし、サンプル^[3]または動的構造に関する一般的な情報を取得するには、多くのFRETペアのデータを記録して組み合わせる必要があります。^[4]

表面固定化実験では、蛍光タグで標識された生体分子がカバーガラスの表面に結合し、蛍光画像が取得されます（通常はCCDまたは科学用CMOSカメラを使用）。^[5]カメラによるデータ収集により、標本の動画が生成され、これを処理して時間とともに単一分子の強度を導き出す必要があります。SPAD検出器を備えた共焦点顕微鏡を使用する場合、最初にサンプルをスキャンして分子検索を行います。次に、共焦点ポイントを分子上に置き、強度と時間のデータを直接収集してサンプルのドリフトを無視できるようにするか、アクティブフィードバックループを使用して分子を追跡します。

表面固定化実験の利点は、光退色までの長時間（通常 1 ～ 30 秒）にわたって多くの分子を並行して観察できることです。これにより、ゆっくりとした時間スケールで起こる遷移を簡単に研究できます。欠点は、分子を表面にリンクするために必要な追加の生化学的修飾と、表面が分子の活動に及ぼす可能性のある摂動です。さらに、単一分子強度の最大時間分解能は、カメラの取得時間（通常 >1 ミリ秒）によって制限されます。

SmFRETは、液体サンプル内で自由に拡散する分子の立体配座を調べるのにも使用できます。自由拡散 smFRET 実験 (または拡散ベースの smFRET) では、同じ生体分子が溶液内で自由に拡散しながら、小さな励起ボリューム (通常は回折限界スポット) によって励起されます。励起スポットを横切る単一分子による光子のバーストは、SPAD検出器で取得されます。共焦点スポットは通常、特定の位置に固定されています (スキャンは行われず、画像は取得されません)。代わりに、励起ボリュームを横切る個々の分子によって放出される蛍光光子が記録され、蓄積され、サンプル内に存在するさまざまな集団の分布が構築されます。この分布の複雑さに応じて、取得時間は約 5 分から数時間まで異なります。

SPAD 検出器を採用したセットアップの際立った利点は、カメラを使用する場合のように「フレーム レート」や固定積分時間によって制限されないことです。実際、カメラとは異なり、SPAD は光子が検出されるたびにパルスを生成しますが、各パルスに 10 ～ 50 ns の解像度で「タイムスタンプ」を付けるには追加の電子機器が必要です。共焦点単一分子 FRET 測定の高時間解像度により、観察者は 10 μs という短い時間スケールでダイナミクスを検出できる可能性があります。ただし、拡散時間 (通常 ~1 ms) よりも長い時間スケールで「遅い」遷移を検出することは、表面固定実験よりも難しく、通常ははるかに長い取得時間が必要です。

通常、ドナーおよびアクセプター蛍光体の両方の蛍光発光は 2 つの独立した検出器によって検出され、FRET 信号は 2 つのチャネルの強度比から計算されます。一部のセットアップ構成では、各スペクトル チャネル (ドナーまたはアクセプター) をさらに 2 つの直交偏光に分割し (したがって 4 つの検出器が必要)、FRET と蛍光異方性の両方を同時に測定できます。他の構成では、3 つまたは 4 つのスペクトル チャネルを同時に取得して、複数の FRET ペアを同時に測定します。CWレーザーとパルス レーザーの両方を励起源として使用できます。パルス レーザーを使用する場合、適切な取得ハードウェアは、いわゆる時間相関単一光子計数(TCSPC) 取得で、最後のレーザー パルスに対する光子到着時間をピコ秒の分解能で測定できます。この構成では、各光子はマクロ時間 (つまり、粗い 10 ～ 50 ns のタイムスタンプ) とマイクロ時間 (つまり、最後のレーザー パルスに対する遅延) によって特徴付けられます。後者は、寿命情報を抽出し、FRET 信号を取得するために使用できます。

2 色素システムの典型的な smFRET データは、ドナー色素とアクセプター色素の蛍光発光強度の時間軌跡であり、2 つのチャネルと呼ばれます。2 つの色素の発光を取得するには、主に 2 つの方法が使用されます。(1) PMT、APD、EMCCD、CMOS カメラなどのカメラの各フレームの固定露光時間を使用する累積測定、(2) PMT または APD 検出器を使用して測定された単一光子到着時間シーケンス。原理は、光学フィルターまたはダイクロイックミラーを使用して 2 つの色素の発光を分離し、2 つのチャネルで測定することです。たとえば、電荷結合素子(CCD) カメラの 2 つの半分を使用するセットアップが文献で説明されています。^[6]

2 色素システムの場合、放出信号を使用して、時間の経過に伴う色素間の FRET 効率を計算します。FRET 効率は、アクセプター色素から放出された光子の数をドナー色素とアクセプター色素の放出の合計で割ったものです。すべての実験で生成される時間軌跡には、不完全または不正確な標識や凝集体からの信号が含まれている可能性があります。これを考慮して、複数の研究グループが、複数のメトリックに基づいて、 またはディープ ニューラル ネットワークを使用して、時間トレースの選択を行う高度なツールを開発しました。 [ ^{7] [ 8]}通常、ドナー色素のみが励起されますが、ドナー色素とアクセプター色素が交互に励起されると、さらに正確な情報が得られます。^[10]単一励起スキームでは、ドナー色素とアクセプター色素の放出は、2 つの色素で収集された光子の数を、2 つのチャネルの光子収集効率で割ったものに過ぎません。光子収集効率は、2 つの波長帯の収集効率、フィルターと光学効率、およびカメラ効率の関数です。これらの効率は、特定の機器の設定に合わせて調整できます。

${\displaystyle FRET={\frac {\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}}{{\tfrac {I_{A}}{\eta _{A}Q_{A}}+{\tfrac {I_{D}}{\eta _{D}Q_{D}}}}}={\frac {I_{A}}{{I_{A}}+\gamma {I_{D}}}}}$

ここで、FRET は、ある期間における 2 つの色素システムの FRET 効率、およびは、同じ期間にそれぞれアクセプター チャネルとドナー チャネルで測定された光子数、およびは 2 つのチャネルの光子収集効率、およびは2 つの色素の量子収率、およびは、顕微鏡の設定に対する 2 つの色素の異なる固有輝度の補正です。したがって、は、色素から放出される実際の光子数を計算します。2 つのチャネルの光子収集効率が似ていて、実際の FRET 距離が重要でない場合は、2 つを= 1 に設定し、2 つの量子収率も 1 に設定できます。 ${\displaystyle I_{A}}$${\displaystyle I_{D}}$${\displaystyle \eta_{A}}$${\displaystyle \eta_{D}}$${\displaystyle Q_{A}}$${\displaystyle Q_{D}}$${\displaystyle \gamma}$${\displaystyle I/\eta }$${\displaystyle \eta}$${\displaystyle \gamma =1}$

累積放出smFRETデータの場合、時間軌跡には主に次の情報が含まれます：(1)状態遷移、(2)ノイズ、(3)カメラのぼやけ（モーションブラーの類似物）、(4)色素の光点滅および光退色。状態遷移情報は、典型的な測定に必要な情報です。ただし、残りの信号はデータ分析を妨げるため、対処する必要があります。

ソフトウェアパッケージのリストはKinSoftChallengeのウェブサイトで見ることができます。^[11]これらのソフトウェアパッケージの比較結果のレポートはここにあります。^{[12] [13]}

色素放出のノイズ信号には通常、カメラ読み出しノイズ、ショットノイズとホワイトノイズ、および実サンプルノイズが含まれ、それぞれが異なる発生源による異なるノイズ分布に従います。実サンプルノイズはシステムの熱擾乱から発生し、FRET 距離の広がり、色素配向分布の不均一、色素放出の変化、高速点滅、および積分時間よりも高速な速度論をもたらします。色素放出の緩やかな変化は、異なる色素を選択することで実験的に回避する必要がある偽陽性状態であると考えられます。その他のノイズは、励起パスと検出パス、特にカメラからのノイズです。最終的に、生の放出データのノイズは、ポアソン分布とガウス分布のノイズの組み合わせになります。各チャネルのノイズは、場合によっては（単一光子検出器など）、強度に依存するガウスノイズ（カウントが高いほどノイズが大きくなります。これは、ガウス関数で表すことができるガウスノイズと振幅の大きいポアソンノイズの組み合わせです）とポアソンバックグラウンドノイズ（信号カウントに依存しない）の合計に簡略化できます。後者のノイズは、チャネルがオフまたは低強度状態（右の図）にあるときに支配的になります。ノイズは、特に比較的高い信号カウントでは、ガウス分布として近似できます。次に、2 つのチャネルのノイズを上記の非線形方程式に組み合わせて、FRET 値を計算します。したがって、smFRET 軌跡上のノイズは非常に複雑です。ノイズは平均 FRET 値の上下で非対称であり、A チャネルと D チャネルの不確実性が変化するため、その大きさは FRET 値の両端（0 と 1）に向かって変化します。ほとんどのノイズは、時間分解能を失うという代償を払って、データをビニングすることによって低減できます（図を参照）。ノイズありとノイズなしのsmFRET時間軌跡をシミュレートするMATLABコードの例については、GitHub（postFRET）を参照してください（GitHubリンク^[14]）。

カメラのぼやけた信号は、測定の離散的な性質から生じます。放出信号は、一方または両方が確率的 (ランダム) であるため、実際の遷移信号と一致しません。2 つの放出読み取り間隔の読み出しの間に状態遷移が発生すると、信号は同じ測定ウィンドウ内の 2 つの部分の平均となり、状態識別精度に影響し、最終的には速度定数の解析に影響します。これは、測定周波数が遷移速度よりもはるかに速い場合にはそれほど問題になりませんが、両者が近づくと大きな問題になります (右の図)。シミュレートされた smFRET 軌跡にカメラのぼやけた効果を反映するには、データ収集時間よりも高い時間分解能 (たとえば 10 倍高速) でデータをシミュレートし、そのデータを最終軌跡にまとめる必要があります。より高速な時間分解能で smFRET 時間軌跡をシミュレートし、それを測定時間分解能 (積分時間) にまとめ、カメラのぼやけた効果をシミュレートする MATLAB コードの例については、GitHub (postFRET ^{) [14]を参照してください。}

時間軌跡には、2 つの染料の光点滅と光退色情報も含まれています。この情報を除去する必要があり、その結果、FRET 情報が失われる時間軌跡のギャップが生じます。測定で選択された比較的長い光点滅間隔と光退色寿命を持つ一般的な染料システムでは、光点滅と光退色情報を除去することができます。したがって、データ分析ではそれほど問題にはなりません。ただし、点滅間隔が短い染料や暗状態寿命が長い染料を使用すると、大きな問題になります。酸素除去剤溶液や三重項状態消光剤など、これら 2 つの問題を軽減するための特定の化学溶液が開発されています。

データを分析するために、閾値法、隠れマルコフモデル(HMM) 法、遷移点識別法など、いくつかのデータ分析方法が開発されています。閾値法は、smFRET 軌跡上の 2 つの隣接する状態の間に閾値を設定するだけです。閾値を超える FRET 値は 1 つの状態に属し、閾値を下回る値は別の状態に属します。この方法は、信号対雑音比が非常に高いデータに対して機能し、したがって FRET 状態を区別できます。この方法は直感的で、長い応用の歴史があります。サンプルのソース コードは、ソフトウェア postFRET にあります。^[14] HMM は、各状態割り当ての確率関数を統計的に計算するアルゴリズムに基づいています。つまり、確率の低い割り当てにペナルティを追加します。典型的なオープンソースコードのソフトウェアパッケージは、HaMMy、vbFRET、ebFRET、SMART、SMACKS、MASH-FRETなどオンラインで見つけることができます。^{[15] [16] [17]}遷移点分析または変化点分析（CPA）は、統計分析を使用して、時間軌跡上で遷移が発生するタイミングを識別するアルゴリズムを使用します。 たとえば、フィッシャー情報理論とスチューデントのt検定法（STaSI、オープンソース、GitHubリンク^{[18] [19]}）に基づくCPAは、状態遷移を識別し、ノイズのペナルティと状態の総数のバランスをとることで、最適な状態数を選択することで記述長を最小限に抑えます。

状態が特定されると、それらを使用して、状態間のフェルスター共鳴エネルギー移動距離と遷移速度定数を計算できます。状態間の並列反応行列の場合、各遷移の速度定数は、各遷移の平均寿命から引き出すことはできません。平均寿命は、速度定数の逆数の合計として固定されています。1 つの状態から他のすべての状態への遷移の寿命は、単一の分子ではすべて「同じ」です。ただし、速度定数は、各遷移の数を、遷移元の状態の合計時間にわたって表す確率関数から計算できます。^[20]

${\displaystyle k_{if}={\frac {N_{if}}{\sum _{f=1}^{f=n}t_{if}}}={\frac {N_{if}}{t_{i}}}}$

ここで、iは初期状態、fは遷移の最終状態、Nは時間軌跡内のこれらの遷移の数、nは状態の総数、kは速度定数、t は遷移が発生する前の各状態の時間です。たとえば、130 秒 (s) の smFRET 時間軌跡を測定します。分子が状態 1 に留まる合計時間はt ₁ = 100 秒 (s)、状態 2 はt ₂ = 20 秒、状態 3 はt ₃ = 10 秒です。分子は 100 秒間、状態 1 に留まり、状態 2 に 70 回遷移し、その滞在時間の終わりに状態 3 に 30 回遷移するため、状態 1 から状態 2 への速度定数はk ₁₂ = 70/100 = 0.7 s ⁻¹、状態 1 から状態 3 への速度定数はk ₁₃ = 30/100 = 0.3 s ⁻¹です。通常、70 回または 30 回の遷移 (滞在時間) の長さの確率は、指数分布します (右の図)。状態 1 の 2 つの分布の平均滞在時間、つまり 2 つの寿命τ ₁₂とτ _{13 は}、これら 2 つの遷移についてどちらも 1 秒で同じです (右の図)。遷移の数Nは、状態遷移の総数、または状態滞在時間の累積ヒストグラムの指数関数的減衰関数の近似振幅になります。後者は、滞留時間分布が適切に機能する場合にのみ機能します。一次反応で各状態が他のすべての状態に並行して移行する平衡状態のシステムは、理解を容易にするための特別なケースです。システムが平衡状態でない場合でも、この方程式は有効ですが、使用には注意が必要です。

上記の式の解釈は、各分子が同じであるという仮定、つまりエルゴード仮説に基づいています。各状態の存在は、その合計時間、つまり「濃度」によって表されます。したがって、他の状態への遷移率は、この濃度で正規化された遷移の数です。数値的には、時間濃度を数濃度に変換して、アンサンブル測定を模倣することができます。^[20]単一の分子は他のすべての分子と同じであるため、時間軌跡は、それぞれが非常に短い時間、たとえば 𝛿 tのみを占める多数の分子のランダムな組み合わせであると想定できます。したがって、状態 n での分子の「濃度」はc _n = t _n / 𝛿 tです。これらすべての「分子」の中で、この測定時間 𝛿 tの間にN _{nf が}状態 f に遷移する場合、定義により遷移率はr = N _nf / 𝛿 t = k _nf c _nです。したがって、k _nf = N _nf / t _nです。

単一分子の速度定数の測定はエルゴード仮説にのみ依存していることがわかります。これは、統計的に十分な数の単一分子が測定され、期待どおりの滞留時間の分布が観察された場合に判断できます。各分子が区別可能な状態セットまたは速度定数セットを持っている場合、単一分子間の不均一性も観察できます。

レート分析の不確実性レベルは、複数の実験試行、ブートストラップ分析、およびフィッティング エラー分析から推定できます。状態の誤割り当ては、データ分析中によく発生するエラーの原因で、状態の広がり、ノイズ、およびカメラのぼやけによって発生します。データ ビニング、移動平均、およびウェーブレット変換は、状態の広がりとノイズの影響を軽減するのに役立ちますが、カメラのぼやけの影響は増大します。

カメラのぼやけ効果は、より高速なサンプリング周波数によって低減できますが、これはより感度の高いカメラの開発、特別なデータ分析、またはその両方に依存します。伝統的に HMM では、遷移の前後のデータ ポイントが特別に割り当てられ、これらのデータ ポイントが遷移間の状態に誤って割り当てられる率が低下します。ただし、この方法には限界があります。遷移周波数がサンプリング周波数に近づくと、データがぼやけすぎてこの方法が機能しなくなります (上記のカメラのぼやけの図を参照)。パルス レーザーを使用した実験的アプローチでは、非常に高速なカメラを使わずにカメラのぼやけ効果を部分的に克服できることが報告されています。^[21]このアイデアは、各カメラ収集サイクルで非常に短い期間のみを照射して、各サイクルでの信号の平均化を回避するというものです。

カメラのぼやけたデータの解析精度を高めるために、2段階のデータ分析法も報告されている。モンテカルロシミュレーション法で軌跡をシミュレートし、それを実験データと比較するというアイデアだ。適切な条件では、シミュレーションと実験データの両方に同程度のぼやけ情報とノイズが含まれる。このシミュレートされた軌跡は、その真実が「既知」であるため、生の実験データよりも優れた答えとなる。この方法には、postFRET ^[22] (GitHubリンク^[14] ) やMASH-FRET ^[16]などのオープンソースコードがある。この方法は、統計的方法を使用して状態を正確に識別する際に問題となる非ガウスノイズの影響をわずかに修正することもできる。

smFRET の現在のデータ解析には依然として細心の注意と特別なトレーニングが必要であり、データ分析の労力を軽減するためにディープラーニング アルゴリズムが役割を果たすことが求められています。

SmFRET は、異種集団のより正確な分析を可能にし、アンサンブル FRET と比較していくつかの利点があります。

単一分子の距離を研究する利点の 1 つは、アンサンブルに基づいて平均を計算するのではなく、各分子に固有の値を使用して異種集団をより正確に研究できることです。これにより、異種集団内の特定の同種集団の研究が可能になります。たとえば、異種集団内の 2 つの既存の相同集団が異なる FRET 値を持つ場合、アンサンブル FRET 分析では、集団全体を表す加重平均 FRET 値が生成されます。したがって、得られた FRET 値では、2 つの異なる集団に関するデータは生成されません。対照的に、smFRET では 2 つの集団を区別できるため、既存の相同集団の分析が可能になります。^[23]

SmFRET は、アンサンブル FRET 測定では達成できない、個々の分子の動的な時間分解能も提供します。アンサンブル FRETは、集団に蓄積するよく分布した遷移状態を検出する能力がありますが、短命で蓄積しない中間体を特徴付ける能力がありません。この制限は、蓄積に関係なく単一分子の中間体を観察する直接的な方法を提供する smFRET によって解決されます。分子を十分に長い時間観察すると、ノイズや他の状態の広がりと区別できるほど長く続く遷移状態のイベントが発生します。したがって、smFRET は、不均一な環境で一時的なサブポピュレーションをキャプチャする能力を示しています。^[24]

平衡状態のシステムにおける運動情報は、反応物と生成物の濃度が時間とともに変化しないため、アンサンブルレベルでは失われます。しかし、単一分子レベルでは、反応物と生成物の間の移動は測定可能な高速度で起こり、時間の経過とともに確率的にバランスが取れます。したがって、特定の分子の時間軌跡をトレースすることで、低濃度のためにアンサンブルレベルでは隠れている中間体を含む、各遷移ステップの速度定数を直接測定できます。これにより、smFRET を使用してDNA、RNA、およびタンパク質の折り畳みダイナミクスを研究できます。タンパク質の折り畳みと同様に、DNA と RNA の折り畳みは、本来の状態に達する前に複数の相互作用、折り畳み経路、および中間体を経ます。

SmFRET は、アンサンブル FRET よりも 3 色システムを利用することが示されています。1 つではなく 2 つのアクセプター蛍光体を使用することで、FRET は複雑な分子の相関運動と空間変化の複数の場所を観察できます。これは、ホリデイ ジャンクションの研究で示されています。3 色システムを使用した SmFRET は、ジャンクションの 3 つのらせん部位の同期した動きと、その平行状態がほとんど存在しないことに関する洞察を提供します。アンサンブル FRET でも 3 色システムを使用できます。ただし、明らかな利点は、蛍光体の信号を明確に分離するなど、3 色システムの要件によって上回られます。信号を明確に区別するには、FRET の重なりを小さくする必要がありますが、これにより FRET の強度も弱まります。SmFRET は、バンドパス フィルターとダイクロイック ミラーを使用して重なりの制限を修正し、2 つの蛍光アクセプター間の信号をさらに増幅し、ブリードスルー効果を解決します。^[25]

smFRET の主な用途は、タンパク質の折り畳みを促進する微細な生化学的ニュアンスを分析することです。近年、タンパク質の折り畳みと展開に関与する単一分子相互作用を調べるための複数の手法が開発されています。原子間力顕微鏡とレーザーピンセットを使用したフォースプローブ手法により、タンパク質の安定性に関する情報が得られています。smFRET を使用すると、研究者は蛍光を使用して分子相互作用を調べることができます。フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET) は、Ha らによって最初に単一分子に適用され、Hochstrasser、Weiss らによる研究でタンパク質の折り畳みに適用されました。smFRET が全体として分子相互作用の分析にもたらした利点は、データのアンサンブルを平均化することなく、単一分子相互作用を直接テストできることです。タンパク質の折り畳み分析では、アンサンブル実験で、折り畳まれた状態と展開された状態の間のさまざまな遷移状態にある複数のタンパク質を測定します。平均すると、データの集合から推測できるタンパク質構造は、タンパク質の折り畳みの基本的な構造モデルしか提供しません。しかし、タンパク質の折り畳みを真に理解するには、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の間の折り畳み経路に沿った構造イベントのシーケンスを解読する必要があります。smFRET が非常に適用できるのは、この特定の研究分野です。

FRET研究では、タンパク質の折り畳み現象を時間分解で観察し、それに応じたFRET効率を計算します。これらのFRET効率は、時間の関数として分子間の距離を推測するために使用できます。タンパク質が折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の間を遷移すると、分子間の対応する距離は、タンパク質の折り畳みにつながる分子相互作用の順序を示すことができます。^[26]

smFRETのもう一つの用途は、DNAとRNAの折り畳みダイナミクスです。^[27]通常、ヌクレオチドの2つの異なる位置がドナー色素とアクセプター色素でラベル付けされます。2つの位置間の距離の変化は、ヌクレオチドの折り畳みと展開、および各測定ウィンドウ内および異なるウィンドウ間での時間の経過に伴う2つのポイントのランダム拡散により、時間の経過とともに変化します。折り畳み/展開の軌跡が複雑なため、アンサンブルレベルでプロセスを測定することは非常に困難です。したがって、smFRETはこの分野の重要な技術になります。smFRETデータ分析の課題に加えて、1つの課題は複数の関心位置にラベルを付けることであり、もう1つの課題は2ポイントダイナミクスから全体的な折り畳み経路を計算することです。

単一分子 FRET は、特定のチャネル内の関連チャネル モチーフの構造変化の研究にも適用できます。たとえば、標識された四量体 KirBac カリウム チャネルは、脂質膜内の構造ダイナミクスを理解するために、特定のサイトでドナーおよびアクセプター蛍光体で標識され、これにより、他の真核生物Kir チャネル、さらには一般的なカチオンチャネルの類似モチーフに同様のダイナミクスを一般化できるようになりました。この実験で smFRET を使用すると、マクロ測定値を単純に平均化した場合には見ることができない構造変化を視覚化できます。これにより、個々の分子とその内部の構造変化の分析ではなく、アンサンブル分析が可能になり、他の真核生物チャネルの類似モチーフに同様のダイナミクスを一般化できます。

KirBacチャネルの構造ダイナミクスは、リガンドPIP2の存在に依存して、開いた状態と閉じた状態の両方で徹底的に分析されています。smFRETに基づく結果の一部は、細胞外領域の構造的剛性を実証しました。選択フィルターと選択フィルター領域の外側のループは蛍光体で標識され、コンフォメーション結合が観察されました。個々のsmFRET軌跡は、チャネルの状態に関係なく、変動のない約0.8のFRET効率を強く実証しました。^[28]

最近、単一分子 FRET は、ターゲット DNA を定量的に検出し、一塩基多型を区別するために適用されています。アンサンブル FRET とは異なり、単一分子 FRET では、ターゲット結合イベントをリアルタイムで監視できます。さらに、単一分子 FRET 技術で観察される低いバックグラウンドと高い信号対雑音比により、超高感度 (フェムトモル範囲の検出限界) が実現します。最近では、検出限界を押し下げるために、さまざまな種類の信号増幅ステップが組み込まれています。

smFRET の限界は、おおよその推定値が得られるにもかかわらず、エネルギー移動に関係する正確な距離を得るのが難しいことです。正確な距離推定値を求めることは大きな課題となります。なぜなら、ドナーおよびアクセプター蛍光体の蛍光、およびエネルギー移動は、環境と色素の配向に依存し、蛍光体が結合する場所の柔軟性によって変化する可能性があるからです。さらに、特定の状態の実際の距離は動的である可能性があり、測定値は収集時間枠内の平均距離を表します。ただし、この問題は、2 つの蛍光体の距離推定値を正確かつ絶対的な精度で決定する必要がない場合は、特に関係ありません。^[6]

遷移速度が数ミリ秒以下である複雑な生物系から運動情報を抽出することは、依然として困難です。現在、このような測定の時間分解能は、通常ミリ秒レベルですが、マイクロ秒レベルの報告もいくつかあります。色素の光物理学には理論的な限界があります。一般的な有機色素分子の励起状態の寿命は約 1 ナノ秒です。FRET 値の統計的信頼性を得るには、数十から数百の光子が必要であり、最良の時間分解能は 1 マイクロ秒のオーダーになります。この限界に達するには、非常に強い光が必要です (通常、顕微鏡を使用してレーザー ビームを集束させることで達成される 1×10 ¹⁰ W m ^−2、10 7 sun のオーダーの電力密度)。これにより、有機分子に光損傷^が発生することがよくあります。もう 1 つの限界は、色素の光退色寿命です。これは、光強度と環境の酸化/還元ストレスの関数です。典型的な実験条件 (レーザー出力密度がわずか数太陽) での典型的な有機染料の光退色寿命は数秒、または酸素除去溶液の助けを借りれば数分です。したがって、数分を超える運動イベントを有機染料で調査することは困難です。有機染料の代わりに、量子ドット、ポリマー ドット、全無機染料などの寿命が長い他のプローブを使用する必要があります。

• ミシガン大学ニルス・ウォルター研究室
• ミシガン大学 リアルタイム単一分子解析（SMART）センター
• ジョンズ・ホプキンス大学医学部ハ研究室
• コーネル大学ブランチャード研究所
• チューリッヒ大学シューラー研究グループ
• ノースカロライナ州立大学ウェニンガー研究所
• オックスフォード大学カパニディス研究グループ
• ハーバード大学荘研究グループ
• シュワルツ研究グループ、コロラド大学ボルダー校
• ライス大学ランデス研究グループ
• オハイオ大学チェン研究グループ
• プリンストン大学ヤン研究グループ
• 北海道大学小松崎研究グループ
• ワイス研究グループ、UCLA
• コロンビア大学ゴンザレス研究グループ
• フライブルク大学ヒューゲル研究グループ