単一分子実験

単一分子実験は、個々の分子の特性を調べる実験です。単一分子研究は、分子の個々の動作を区別できず、平均的な特性しか測定できない分子の集合体またはバルクの集合体の測定とは対照的です。生物学、化学、物理学の多くの測定技術は単一分子を観察できるほど感度がないため、単一分子蛍光技術（個々の分子レベルでさまざまなプロセスを調べるために1990年代以降に登場）は、測定されたプロセスに関する多くの新しい詳細を提供し、過去にはアクセスできなかったため、大きな注目を集めました。実際、1990年代以降、個々の分子を調べるための多くの技術が開発されました。^[2]

最初の単一分子実験は1970 年代に行われたパッチクランプ実験でしたが、これらはイオンチャネルの研究に限定されていました。今日、単一分子技術を使用して調査されるシステムには、筋肉組織のアクチンフィラメント上のミオシンの動きや、固体内の個々の局所環境の分光学的詳細が含まれます。生物学的ポリマーの立体配座は、原子間力顕微鏡(AFM) を使用して測定されてきました。力分光法を使用すると、単一分子 (または相互作用する分子のペア)、通常はポリマーを機械的に引き伸ばし、その弾性応答をリアルタイムで記録できます。

超低圧の気相では、単一分子実験は数十年前から行われてきましたが、凝縮相では1989年のWEモーナーとローター・カドールの研究以来のことでした。^[3] 1年後、ミシェル・オリットとジャッキー・バーナードは、単一分子の吸収を蛍光で検出することもできました。^[4]

多くの技術には、一度に 1 つの分子を観察する機能があり、最も有名なのは、単一のイオンを検出する質量分析法です。さらに、単一分子を検出する最も初期の方法の 1 つは、イオン チャネルの分野で、エルヴィン ネーアーとバート ザックマン(後に独創的な貢献によりノーベル賞を受賞) によるパッチ クランプ技術の開発によって生まれました。しかし、単一分子を観察するために伝導度を測定するというアイデアは、観察できるシステムの種類に重大な制限を課しました。

蛍光は、単一光子をカウントできる市販の光検出器の感度のおかげで、一度に 1 つの分子を観察する便利な手段です。ただし、分光学的に、1 つの分子を観察するには、分子が隔離された環境にあり、励起時に光子を放出する必要があります。光電子増倍管 (PMT) またはアバランシェ フォトダイオード (APD) を使用して単一光子を検出する技術により、光子放出イベントを優れた感度と時間分解能で記録できます。

最近では、単一分子蛍光は、タンパク質やヌクレオチドなどの生体分子にラベルを付けることにより、触媒作用や構造再編成における微妙な時間依存の動きのため、バルク規模では簡単には研究できない酵素機能を研究する生物学的イメージングの分野で大きな関心を集めています。最も研究されているタンパク質は、筋肉組織に見られるミオシン/アクチン酵素のクラスです。単一分子技術により、これらのタンパク質の多くでステップメカニズムが観察され、特徴付けられています。

1997年に、MITのKatrin Kneipp、H. Kneipp、Y. Wang、LT Perelmanら^[5]と、インディアナ大学のS. NieとSR Emoryがそれぞれ独立して表面増強ラマン分光法（SERS）による単一分子検出を実証しました。^[6] MITチームは、非共鳴ラマン励起と銀ナノクラスターによる表面増強を使用して単一のクレシルバイオレット分子を検出し、インディアナ大学のチームは共鳴ラマン励起と銀ナノ粒子による表面増強を使用して単一のローダミン6G分子を検出しました。

原子間力顕微鏡などのナノマニピュレーターは、ほとんどの生物学的ポリマーと同じ長さスケールで動作するため、生物学的に重要な単一分子実験にも適しています。また、原子間力顕微鏡 (AFM) は合成ポリマー分子の研究に適しています。AFM は、ポリマー鎖の 3D 視覚化の独自の可能性を提供します。たとえば、AFM タッピング モードは、液体媒体下で吸着されたポリ電解質分子 (たとえば、厚さ 0.4 nm のポリ (2-ビニルピリジン) 鎖) を記録するのに十分なほど穏やかです。これらの実験では、2 つの鎖の重ね合わせの位置は、単一鎖の厚さの 2 倍 (前述の例では 0.8 nm) に対応します。適切なスキャン パラメーターを適用すると、このような分子の立体配座は数時間にわたって変化しないため、さまざまな特性を持つ液体媒体下での実験を実行できます。^[1]さらに、先端とサンプル間の力を制御することで、高解像度の画像を取得できます。^{[7] [8]} 光ピンセットはDNA-タンパク質相互作用の研究や定量化にも使用されている。^{[7] [8]}

単分子蛍光分光法では、分子の蛍光を利用して、その環境、構造、位置に関する情報を取得します。この技術により、アンサンブル平均化では得られない情報を取得できるようになります (つまり、多数の分子を同時に記録したときに得られる信号は、分子のダイナミクスの平均特性を表します)。個々の分子の多くの実験の結果は、2 状態軌跡です。

単一分子蛍光分光法の場合と同様に、単一チャネル記録と呼ばれる技術を使用して、全細胞記録などのアンサンブル記録では得られない特定の運動情報（この場合はイオンチャネル機能に関する情報）を取得できます。^[9] 具体的には、イオンチャネルは、構造が異なる伝導クラスと非伝導クラスを交互に繰り返します。したがって、ノイズを最小限に抑えるための適切な予防措置が講じられている限り、十分に感度の高い電子機器を使用してイオンチャネルの機能状態を直接測定できます。次に、これらの各クラスは、イオンチャネルの基礎となる機能に直接関係する 1 つ以上の運動状態に分けることができます。これらのタイプの単一分子研究を体系的に変化する条件（アゴニストの濃度と構造、透過イオンおよび/またはチャネル遮断薬、イオンチャネルアミノ酸の変異など）で実行すると、イオンチャネルのさまざまな運動状態の相互変換に関する情報が得られます。^{[10]イオンチャネルの最小モデルには、開状態と閉状態の}2 つの状態 があります。しかし、データを正確に表現するためには、複数の閉じた状態や、刺激があっても発生する可能性がある非伝導状態である非活性状態や脱感作状態など、他の状態が必要になることがよくあります。^[9]

単一の蛍光体は、タンパク質や DNA などの生体分子に化学的に結合し、蛍光プローブをモニタリングすることで個々の分子のダイナミクスを追跡できます。レイリー限界内の空間的な動きを追跡できるほか、発光強度や放射寿命の変化も追跡できます。これらは多くの場合、局所環境の変化を示しています。たとえば、単一分子標識により、キネシンモータータンパク質が筋細胞内の微小管に沿ってどのように移動するかについて、膨大な情報が得られました。生細胞での単一分子イメージングにより、生理学的環境下でのタンパク質のダイナミクスに関する興味深い情報が明らかになります。拡散係数、平均二乗変位、滞留時間、結合分子と非結合分子の割合、生細胞内の標的部位へのタンパク質結合の標的探索メカニズムなど、タンパク質のダイナミクスに関するいくつかの生物物理学的パラメータを定量化できます。^[11]

メイン記事smFRET。

単一分子蛍光共鳴エネルギー移動では、分子は（少なくとも）2か所で標識されます。レーザービームは、最初のプローブを励起する分子に焦点を合わせます。このプローブが緩和して光子を放出すると、他のプローブを励起する可能性があります。最初のプローブから放出された光子が2番目のプローブに吸収される効率は、これらのプローブ間の距離に依存します。距離は時間とともに変化するため、この実験では分子の内部ダイナミクスを調べます。

個々の分子に関連するデータを見るとき、通常は、1次、2次などのプロパゲーターとジャンピングタイム確率密度関数を構築できますが、バルク実験からは通常、相関関数の減衰が得られます。^[12]これらの固有の関数（個々の分子から取得）に含まれる情報から、システムの挙動に関する比較的明確な画像、たとえば、その速度論的スキーム、またはその活性の可能性、またはその縮小次元形式を抽出することができます。^{[13] [14]}特に、個々の酵素の活性をモニタリングするときに、酵素の反応経路（の多くの特性）を構築できます。^[15]さらに、フィッティング方法や均質な集団のテストなど、単一分子データの分析に関する重要な側面は、複数の著者によって説明されています。^[9]一方、単一分子データの解析には、低ノイズ環境と絶縁ピペットチップの構築、記録中に残っている不要な成分（ノイズ）の一部のフィルタリング、データ解析（前処理、明確なイベント検出、データのプロット、運動学スキームのフィッティングなど）に必要な時間の長さなど、いくつかの問題があります。

単一分子技術は光学、電子工学、生物学、化学に影響を与えた。生物科学では、タンパク質やその他の複雑な生物学的機構の研究は、その運動を直接観察することがほぼ不可能な集団実験に限られていた。例えば、単一分子蛍光顕微鏡法が筋肉組織内のキネシン-ミオシンペアの研究に使用されて初めて、歩行機構の直接観察が理解された。しかし、これらの実験は、生細胞イメージングの有用な技術がまだ完全に実現されていないため、大部分はin vitro研究に限定されている。しかし、単一分子in vivoイメージングの有望性は、^[16]ネイティブプロセスで生体分子を直接観察する大きな可能性を秘めている。これらの技術は、多くがまだ発見されている低コピータンパク質に関する研究を対象とすることが多い。これらの技術は、不均一な表面のマッピングを含む化学の研究分野にも拡張されている。^[17]

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