核酸の核磁気共鳴分光法

核酸NMRは、核磁気共鳴分光法を用いてDNAやRNAなどの核酸分子の構造と動態に関する情報を得る手法である。100ヌクレオチドまでの分子に有効であり、2003年時点で、既知のRNA構造のほぼ半分がNMR分光法によって決定されている。^[1]

NMRは、分子の構造特性に影響を与える可能性のある結晶格子ではなく、分子が自然な溶液状態で観察される点で、高解像度の核酸構造決定のもう1つの方法であるX線結晶構造解析よりも優れています。NMRでダイナミクスを調査することも可能です。ただし、結晶構造解析よりも若干精度と詳細さが劣ります。^[2]

核酸NMRはタンパク質NMRと同様の技術を使用するが、いくつかの違いがある。核酸には、NMRで通常観察される原子である水素原子の割合が少なく、核酸の二重らせんは硬くほぼ直線状であるため、それ自体に折り返されず、「長距離」相関関係が得られない。また、核酸はタンパク質よりも狭い範囲に共鳴が分布する傾向があるため、スペクトルが混雑して解釈が困難になる可能性がある。^[3]

核酸では、ほとんどの場合、2次元NMR法が用いられる。これには、核結合を介した結合を検出する相関分光法（COSY）と全コヒーレンス移動分光法（TOCSY）、および空間的に互いに近接する核間の結合を検出する核オーバーハウザー効果分光法（NOESY）^が含まれる。核酸で通常行われるNMRの種類は、 ^1H NMR、^13C NMR、^15N NMR、および^31P NMRである。 天然核酸にはフッ素原子が含まれていないため、2'-フルオロ-2'-デオキシアデノシンなどの非天然ヌクレオチドが核酸鎖に組み込まれている場合、19F NMRも有用である。^{[2] [4]}

¹ Hと³¹ Pはほぼ100%の自然存在比を持ち、¹³ Cと¹⁵ Nは自然存在比が低い。後者の2つの核については、分子内の所望の原子を均一にまたは部位特異的に同位体濃縮する能力がある。13 Cおよび/または15 Nが均一に濃縮されたヌクレオチドは^、同位^体濃縮環境で増殖した細菌由来のdNTPまたはNTPを使用してポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、生化学的方法によって得ることができる。部位特異的同位体濃縮は、標識ヌクレオシドホスホラミダイトモノマーおよび完全な鎖の化学合成によって行う必要があるが、これらは合成が難しく費用もかかる。^{[1] [5]}

核酸は溶媒交換可能なプロトンを比較的多く含んでいるため、核酸 NMR は他の種類の NMR でよく見られるD ₂ O溶媒では行われません。これは、溶媒中の重水素が交換可能なプロトンを置き換え、その信号を消してしまうためです。H ₂ O が溶媒として使用され、通常のパルスシーケンスの前に溶媒信号を飽和させる (「プレサチュレーション」) などの他の方法を使用して強い溶媒信号を除去します。これは、飽和した溶媒プロトンと核酸プロトンの交換を防ぐために低温で最も効果的です。または、関心のある共鳴のみを励起する (「選択励起」) 方法もありますが、これにはピーク振幅を歪めるという望ましくない追加効果があります。^[2]

交換可能なプロトンと交換不可能なプロトンは、通常、2 つの独立したグループとして特定のピークに割り当てられます。交換可能なプロトン (大部分は塩基対形成に関与するプロトン) の場合、NOESY を使用して、隣接する塩基間の空間を介した相関関係を見つけることができ、これにより、連続ウォーキングによって二重鎖分子全体を割り当てることができます。交換不可能なプロトン (その多くは核酸の糖部分にある) の場合、COSY と TOCSY を使用して結合した核のシステムを特定し、NOESY を再び使用して、糖と塩基、および各塩基と隣接する塩基を相関させます。二重鎖 DNA の交換不可能なプロトンの場合、塩基上の H6/H8 プロトンは、隣接する塩基の対応するプロトンおよび糖上の H1' プロトンと相関するため、連続ウォーキングが可能になります。RNA の場合、化学構造とらせん構造の違いにより、この割り当ては技術的に難しくなりますが、それでも可能です。シーケンシャルウォーキング法は非二重らせん核酸構造やZ-DNA構造では不可能であり、共鳴の割り当てがより困難になる。^{[2] [3]}

スペクトルから得られるパラメータ、主にNOESYクロスピークと結合定数は、グリコシド結合角、二面角（Karplus方程式を使用）、糖パッカー配座などの局所的な構造特性を決定するために使用できます。イミノプロトン共鳴の有無、または水素結合を介した^15個のN原子間の結合の有無は、塩基対形成の有無を示します。大規模構造の場合、これらの局所パラメータは、他の構造仮定またはモデルで補完する必要があります。これは、二重らせんを横切るにつれて誤差が加算され、タンパク質とは異なり、二重らせんはコンパクトな内部を持たず、それ自体に折り返されないためです。ただし、核酸分子に弱い整列を課す媒体での残留双極子結合実験を通じて、長距離配向情報を取得できます。 ^{[1] [2]}

最近、固体NMR法が核酸の構造決定に導入されました。^{[6]このプロトコルには、} RNAのヌクレオチド型選択的標識と異核相関実験の使用という2つのアプローチが含まれています。

NMR は、曲がったらせん、非ワトソン・クリック塩基対形成、同軸スタッキングなどの非標準形状の調査にも有用である。ステムループや擬似ノットなどの複雑な立体配座をとる傾向がある天然の RNA オリゴヌクレオチドの構造を調べるのに特に有用である。RNAと金属イオンの相互作用は、イオン結合時の化学シフトの変化の観察、常磁性イオン種の線幅の拡大の観察、金属イオンの有機金属模倣体の分子間 NOE 接触の観察など、さまざまな方法で調べることができる。NMR は、核酸分子とタンパク質や薬物などの他の分子との結合を調べるのにも有用である。これは、他の分子の結合時にどの共鳴がシフトするかを見る化学シフト マッピング、または結合分子の 1 つが選択的に飽和し、結合すると複合体内の他の分子に飽和が移る交差飽和実験によって行うことができる。^{[1] [2]}

二本鎖-一本鎖平衡や二本鎖への他の分子の結合速度などの動的特性も、スピン-格子緩和時間T _{1への影響によって決定できますが、これらの方法は 10} ⁴ –10 ⁸ s ⁻¹の中間速度には鈍感であるため、固体 NMRなどの他の方法で調査する必要があります。核酸二重らせんの曲げやねじれなどの機械的特性のダイナミクスも NMR を使用して研究できます。 パルス磁場勾配NMR 実験は拡散定数の測定に使用できます。^{[1] [2] [7]}

核酸 NMR 研究は 1971 年という早い時期に行われており^[8]、低磁場イミノプロトン共鳴を使用して塩基対形成相互作用を調べることに重点が置かれていました。これらの初期の研究は tRNA に重点が置かれていました。これは、これらの核酸が、NMR スペクトルの線幅が実用的なほど分子量が低い、当時入手可能な唯一のサンプルだったためです。この研究が低磁場プロトンに重点を置いたのは、当時入手可能な最高の分光計を使用して水溶液中で確実に観測できる唯一のプロトンだったためです。低磁場イミノプロトンのスペクトルが、溶液中の tRNA の三次構造の手がかりを提供していることがすぐに認識されました。二重らせん DNA の最初の NMR スペクトルは、合成の 30 塩基対二重らせんを使用して 1977 年に発表されました^[9]。天然 DNA の著しい線幅の広がりを克服するために、完全に分解された天然 DNA が準備され、二重らせん DNA の持続長を調べるために研究されました。^[10]同時に、ヌクレオソームコア粒子の研究が行われ、二重らせんの柔軟性に関するさらなる知見が得られた。^[11]制限酵素を用いて作製された均一な低分子量ネイティブ配列DNAの最初のNMRスペクトルは、1981年に報告された。 ^[12]この研究は、高磁場で得られた核酸NMRスペクトルの最初の報告でもあった。2次元NMR研究は1982年に報告され始め^{[13] 、その後、}オリゴヌクレオチド合成とより洗練された機器の登場により、1983年から多くの詳細な構造研究が報告された。^[14]