フィールドフローフラクショネーション

フィールドフローフラクショネーション（略してFFF）^[1]は、 J.カルビン・ギディングスが発明した分離技術です。この技術は、固定相を持たない分離プラットフォームを流れる液体溶液中のコロイド状または高分子量物質の分離に基づいています。流れる溶離液によって運ばれる溶質の希薄溶液または懸濁液に作用するため、液体クロマトグラフィーに似ています。分離は、長くて狭い層流チャネルを通じてポンプで送られるサンプルの輸送方向に対して垂直なフィールド（油圧、遠心、^[2]熱、^[3]電気、^[4]磁気、^[5]重力など）またはクロスフローを適用することによって達成されます。フィールドはサンプル成分に力を及ぼし、蓄積壁と呼ばれるチャネル壁の1つに向かって成分を集中させます。^[6]力はサンプルの特性と相互作用し、それによって分離が起こります。言い換えれば、成分は交差場によって及ぼされる力の下で異なる「移動度」を示します。例として、油圧またはクロスフローFFF法の場合、分離を促進する特性は並進拡散係数または流体力学的サイズです。熱場（一方の壁を加熱し、もう一方の壁を冷却する）の場合、分離を促進する特性は熱拡散係数と並進拡散係数の比です。

FFFは、「通常」モードではサブミクロン範囲（1nmから数ミクロン）に適用でき、いわゆる立体^{[7] [8]モードでは最大50ミクロンまで適用できます。通常モードから立体モードへの移行は、1}ミクロンを超えるサイズで拡散が無視できるようになったときに発生します。FFFは、1回の分析で分離できる可溶性高分子^[9]と粒子またはコロイドの両方をカバーする広いダイナミックレンジのサイズで独特です。

代表的な用途としては、高分子量ポリマーおよびポリマー複合材料、ナノ粒子（工業用および環境用）、ウイルスおよびウイルス様粒子、脂質ナノ粒子、細胞外小胞、その他の種類の生物学的サンプルなどがあります。

FFF は、HPLC や SEC で知られているすべてのタイプの検出器と組み合わせることができます。FFF は液体移動相がチャネルを通過する点で液体クロマトグラフィーに似ているため、最も一般的な検出器は LC でも使用されている検出器です。最も頻繁に使用されるのは、非破壊的な性質を持つ UV-VIS 検出器です。多角度光散乱と組み合わせると、溶出画分のサイズを計算し、FFF 理論で得られた値と比較できます。もう 1 つの一般的な特異的検出は、高い特異性と感度で金属ナノ粒子を特徴付ける 誘導結合プラズマ質量分析です。

FFF は、サイズ排除クロマトグラフィーなどの他の分離方法では特性評価できない可能性のある複雑で不均質なサンプルの物理的な分離を提供します。固定相がないため、表面やカラム充填材との相互作用が少なくなります。分離は、分離場の強度を調整することで調整できます。FFF は穏やかな方法であり、壊れやすいサンプルに物理的なストレスを与えず、キャリア溶液は最高のサンプル安定性を考慮して調整できます。FFF にはよく練られた理論があり、試行錯誤の実験を繰り返すことなく、最適な結果に到達するための分離条件を見つけることができます。また、FFF 理論からサンプル画分の物理的パラメータの情報を引き出すこともできますが、ほとんどすべてのユーザーは、溶出サンプル画分のサイズを測定するために主に光散乱検出器に依存しています。

FFF は拡散が速いため、小さな分子には適していません。効果的な分離を行うには、サンプルを蓄積壁のすぐ近く (距離 10 μm 未満) に濃縮する必要があります。そのためには、力場によって生じるドリフト速度が拡散係数に比べて 2 桁高くなければなりません。FFF チャネルで生成できる最大場強度によって、分離の下限サイズ範囲が決まります。現在の機器では、これは約 1 nm です。

FFF は非常に汎用性の高い技術ですが、すべての用途に「万能」な方法はありません。FFF 方法にはそれぞれ専用の機器が必要です。現在、いわゆる非対称フロー フィールドフローフラクショネーション(AF4) ^[10]のみが広く使用されています。遠心、熱、電気 FFF などの他の方法は、まだニッチな存在です。

FFF の動作はカラムクロマトグラフィーとは異なっており、HPLC や SEC ユーザーにとっては直感に反する場合があります。この方法を正しく適用するには、FFF の動作原理を理解することが不可欠です。

FFFは、1966年^[11] と1976年^[1]にJ.カルビン・ギディングスによって考案され、初めて発表されました。ギディングスは、今日最も重要なFFF技術であるフローFFF ^{[12]に関する多くの論文を発表しました。FFFの発明者として名高いギディングスは、}ユタ大学の化学教授であり、クロマトグラフィーと分離技術の専門家でした。

前述のように、フィールドフローフラクショネーションでは、フィールドは水力（蓄積壁として半透膜を通過するクロスフロー）、重力、遠心、熱、電気、または磁気のいずれかになります。すべての場合において、分離メカニズムは、拡散の力との定常平衡にある、フィールドの力による粒子の移動度の差によって生成されます。フィールドは蓄積壁に向かって下向きのドリフト速度と濃度を誘発し、拡散はこの濃度勾配に逆らって機能します。一定の時間（緩和時間と呼ばれる）が経過すると、2 つの力は定常平衡で均衡します。これは、すべてのコンポーネントが一定に動いているが、蓄積壁からチャネルに向かって平均濃度が指数関数的に減少している粒子クラウドとして最もよく視覚化されます。海面から上昇する空気圧の減少は、気圧式で説明されているのと同じ指数関数的な減少を示します。緩和が達成された後、チャネルの流れがアクティブになると溶出が始まります。細いチャネル（通常高さ 250 ～ 350 μm）では、放物線状の層流速度プロファイルが存在し、これは集積壁からの距離が増加するにつれて流速が大幅に増加するという特徴があります。これにより、チャネルの壁からの平衡位置に基づいて、特定の粒子の速度が決まります。集積壁に近い粒子は、それより上の粒子に比べて移動速度が遅くなります。粒子の速度と流体の平均速度の比は、保持率 Rと呼ばれます。FFF で効率的に分離するには、 R を 0.2 未満にする必要があり、通常の値は 0.02 ～ 0.1 の範囲です。

フィールドフローフラクショネーションにおける分離は、層流チャネルで行われます。これは、スペーサーで分離された上部ブロックと下部ブロックで構成されています。スペーサーには、ブロック間で密閉されるチャネルボリュームを作成するための切り抜き（長方形または台形）の空隙があります。または、チャネルを上部ブロックに空洞として削り込むこともできます。チャネルは、力場を適用できるように設計されているため、各 FFF 方法には専用のチャネルが必要です。サンプルは、希釈溶液または懸濁液でチャネルに注入され、キャリア溶液がチャネルを通じてポンプで送られるときに、入口から出口への移動中に分離されます。チャネル出口の下流には、溶出画分を分析する 1 つまたは複数の検出器が配置されます。

ギディングス氏とその同僚は、すべての FFF 方法に共通する一般的な保持方程式を説明する理論を開発しました。

分離力場と保持時間の関係は、第一原理から導き出すことができます。FFF チャネル内の 2 つの粒子集団を考えてみましょう。交差場は両方の粒子雲を下部の「蓄積」壁に向かって動かします。この力場に対抗するのは、粒子の自然拡散、つまりブラウン運動で、反対方向に作用する動きを生み出します。これら 2 つの輸送プロセスが平衡に達すると、粒子濃度 c は、式 ( 1 ) に示すように、蓄積壁上の高度 x の指数関数に近づきます。

${\displaystyle \ell}$は粒子雲の特徴的な高度を表します。これは、粒子雲がチャネル内に到達する平均高度に関係し、の値が粒子集団に対して異なる場合にのみ分離が発生します。 各成分の は、個々の粒子に適用される力、または拡散係数Dとドリフト速度Uの比に関係します。^[13]${\displaystyle \ell}$${\displaystyle \ell}$

k はボルツマン定数、T は絶対温度、F は力場によって単一粒子に及ぼされる力です。これは、特徴的な高さの値が、加えられた力に反比例することを示しています。したがって、F が分離プロセスを制御します。したがって、場の強度を変えることで、分離を制御して最適なレベルを達成できます。

分子雲の速度 V は、放物線状のフロー プロファイルに埋め込まれた指数分布の平均速度にすぎません。

保持時間 t _{r は}次のように表すことができます。

ここで、L はチャネルの長さです。

FFF では、保持は通常、保持率で表されます。保持率は、ボイド時間 t ₀ (保持されないトレーサーの出現) を保持時間 t _rで割った値です。保持方程式は次のようになります。

ここで、はチャネルの厚さまたは高さ w で割られます。 の代わりに kT/F を代入すると、適用される横方向の力に対する保持率が示されます。 ${\displaystyle \lambda}$${\displaystyle \ell}$${\displaystyle \ell}$

効率的な操作のためには、チャネルの厚さの値 w は をはるかに超えます。この場合、括弧内の項は 1 に近づきます。したがって、式 5 は次のように近似できます。 ${\displaystyle \ell}$

したがって、t _{r は}F にほぼ比例します。保持時間の有限増分 ∆t _rで表される粒子バンド X と Y の分離は、それらの間の力の増分 ∆F が十分な場合にのみ達成されます。これを実現するには、 わずか 10 ⁻¹⁶ Nの力の差が必要です。

F と ∆F の大きさは、粒子の特性、場の強度、場の種類によって異なります。これにより、技術のバリエーションや適応が可能になります。この基本原理から、適用される分離力の性質や対象となる分子サイズの範囲に応じて、さまざまな形態の FFF が開発されました。

FFF では、カラムクロマトグラフィー技術のクロマトグラムとは対照的に、検出器信号を時間の関数として表示することをフラクトグラムと呼びます。フラクトグラムは、FFF 理論や検出器信号を使用して、分析対象物の 1 つまたは複数の物理的特性の分布図に変換できます。これには、サイズ、モル質量、電荷などがあります。

多くの場合、これらの物質は、最初は少量の液体バッファーに浮遊し、バッファーによって FFF チャネルに沿って押し出された粒子です。特定の粒子種の速度が変化する理由は、粒子のサイズ、質量、および/または不均一な流速を持つチャネルの壁からの距離による可能性があります。したがって、サンプル内の異なる種の存在は、長いチャネルの少し離れた場所で共通の特性を検出し、その結果得られるフラクトグラムによって、各種の到着時間特性の違いと物理的および化学的特性により、ピークによってさまざまな種の存在を示すことで識別できます。

現在利用可能な技術のほとんどは、ギディングス教授が約 40 年前に最初に考案した技術の進歩です。

これらの技術のうち、フロー FFF が最初に商業的に提供されました。フロー FFF は、密度とは関係なく、粒子をサイズに基づいて分離し、1 nm から 1 μm の範囲の高分子を測定できます。この点で、これは最も汎用性の高い FFF サブ技術です。フロー FFF のクロス フローは、チャネル上部の多孔質フリットから入り、蓄積壁 (つまり底壁) の半透膜出口フリットから出ます。対称フローは、過去 20 年間で非対称フローに置き換えられました。

中空糸フローFFF（HF5）は、Leeら（1974）によって開発されました。^[14] HF5は、タンパク質やその他の高分子の分析に応用されています。HF5は、1974年に開発された最初のフローFFFでした。HF5の利点は、日常的なアプリケーションで簡単に交換できる使い捨てのチャネルユニットを提供することです。HF5の欠点の1つは、膜材料の選択肢が限られていることです。ポリエーテルサルフォン（PES）膜のみが利用可能です。現在、HF5は柔軟性に欠け、サンプル負荷に制限があるため、広く使用されていません。

一方、非対称流 FFF ( AF4 ) では、チャネルの底壁に半透膜が 1 つだけあります。したがって、チャネルの底から出るキャリア液体によってクロスフローが生成されます。これにより、非常に穏やかな分離と「非常に広い」分離範囲が実現します。使用されている FFF 機器の大部分は AF4 システムです。主な用途は、タンパク質、ウイルスおよびウイルス様粒子、リポソームの医薬品研究開発です。AF4 は水性溶媒および有機溶媒に適用できるため、この技術で有機ポリマーも分離できます。

高温非対称フロー フィールドフローフラクショネーションは、150 ℃ を超える温度で溶解する高モル質量および超高モル質量ポリマーの分離に使用できます。

熱 FFF は、その名前が示すように、チャネルに温度勾配を適用することで分離力を確立します。チャネルの上部壁は加熱され、下部壁は冷却され、熱拡散によってポリマーと粒子が冷たい壁に向かって移動します。熱 FFF は、有機溶媒中の合成ポリマーを分離する技術として開発されました。熱 FFF は、分子量と化学組成の両方で高分子を分離できるため、同じ分子量のポリマー部分を分離できるという点で、FFF 技術の中でもユニークです。今日、この技術は、ポリマー、ゲル、ナノ粒子の特性評価に最適です。

熱FFFの主な利点の1つは、分離チャネルの寸法がシンプルで非常に明確に定義されていることです。これにより、熱FFFのキャリブレーション定数が、ポリマーのみに依存する通常の（分子）拡散係数Dと熱拡散係数（または熱泳動移動度）D _Tの比率を厳密に表すため、ラボ間または機器間のユニバーサルキャリブレーションが可能になります。したがって、ThFFFユニバーサルキャリブレーションは機器とラボ間で転送可能ですが、よく知られているサイズ排除クロマトグラフィーユニバーサルキャリブレーションは、同じ機器上でのみポリマー間で転送可能です。^[15]

スプリットフロー薄層セル分画（SPLITT）^[16]は、重力^[17]、電気^[18]、または拡散差を利用して、連続的にμmを超えるサイズの粒子を分離する特別な分取FFF技術です。SPLITTシステムには、2つの入口と2つの出口があります。これは、チャネルの開始時に液体に浸したサンプルを1つの入口に低流量で送り込み、同時にキャリア液を2番目の入口にはるかに高い流量で送り込むことによって実行されます。2つの入口ストリームと2つの出口ストリームの流量比を制御することで分離を制御でき、サンプル成分は2つの異なるサイズの画分に分離されます。分離力として重力のみを使用するため、SPLITTは最も感度の低いFFF技術であり、1μmを超える粒子に限定されます。

遠心 FFF では、分離フィールドは遠心力によって生成されます。チャネルはリングの形をしており、実行中にプログラム可能な回転速度で回転します。フローとサンプルはチャネルにポンプで送り込まれ、遠心分離され、オペレーターは粒子を質量 (サイズと密度) で分離できます。遠心 FFF の利点は、粒子サイズが粒子質量の 3 乗に比例するため、加える力を変えることで高いサイズ分解能を実現できることです。

遠心 FFF のユニークな利点は、十分な浮力密度を与えられた場合に高解像度を実現できる技術能力にあります。これにより、サイズがわずか 5% 異なる粒子の分離が可能になります。

遠心FFFの利点は、粒子と高分子を粒子サイズだけでなく粒子密度で分離できることです。この例では、同じサイズの金と銀のナノ粒子を、金と銀のナノ粒子の密度の違いに応じて2つのピークに分離できます。

AF4 分離では、質量と時間の比率は 1:1 です。遠心 FFF に密度という 3 番目のパラメータを追加すると、質量と時間の 3 乗に近い比率になります。これにより、ピーク間の区別が大幅に大きくなり、解像度が大幅に向上します。これは、複合材料やナノ粒子を含むコーティングされたポリマーなどの新しい製品、つまりサイズは変わらないが密度が異なる粒子に特に役立ちます。この方法では、密度が異なる場合、2 つの同一サイズの粒子を 2 つのピークに分離できます。

この方法の限界は、サンプルの密度に依存するサイズの下限にあります。特に生物学的サンプルの場合、限界は直径 20 ～ 50 nm 程度です。

電気FFFでは、横方向の電流（DC）が印加され、電界が形成される。サンプル成分の電荷に応じて、電気泳動ドリフト速度が誘発され、ブラウン運動による拡散によって相殺されるため、分離は電気泳動移動度とサイズの比率に依存する。電気FFFの適用は限られており、現在ではほとんど使用されていない。他の改良法、すなわち特殊な交流が印加される周期的電気FFFが開発されている。これにより、電気泳動移動度に応じて分離することができる。別のバリエーションは、クロスフローフィールドに加えて電界が印加される電気非対称フローFFF（EAF4）である。EAF4は、解像度が低く、電気分解生成物や気泡がチャネル流出物を汚染し、検出器信号を損なうという純粋な電気FFFの制限を克服している。^[19]

• Roda, A. (2005). 「マルチアナライト免疫アッセイ に向けて: 化学発光検出によるフローアシスト固相フォーマット」。臨床化学。51 (10): 1993–1995。doi : 10.1373/ clinchem.2005.053108。ISSN 0009-9147。PMID 16299900  。