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マイクロ流体細胞培養は、生物学、生化学、工学、物理学の知識を統合して、マイクロスケールで細胞を培養、維持、分析、実験するためのデバイスと技術を開発します。[1] [2]これは、人工的に製造されたマイクロシステム内で小さな流体量（μL、nL、pL）を操作するために使用される一連の技術であるマイクロ流体工学と、制御された実験室環境での細胞の維持と成長を伴う細胞培養を統合したものです。 [3] [4]マイクロ流体チャネルの寸法が細胞の物理的スケール（10マイクロメートルのオーダー）に適しているため、マイクロ流体は細胞生物学の研究に使用されてきました。 [2]たとえば、真核細胞の線形寸法は10〜100μmであり、マイクロ流体寸法の範囲内です。[4]マイクロ流体細胞培養の重要な要素は、細胞の構造、機能、挙動、成長を制御する可溶性因子を含む細胞微小環境を模倣できることです。[2]このデバイスのもう一つの重要な要素は、生体内で安定した勾配を作り出す能力であり、これらの勾配は細胞に対する走化性、硬直性、接着性の効果を理解する上で重要な役割を果たします。[2]
製作
細胞培養に関連するマイクロ流体デバイスの考慮事項には次のものがあります。
- 製造材料（例：ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリスチレン）
- 文化 地域 幾何学
- 受動的な方法（重力駆動流、毛細管ポンプ、ラプラス圧力に基づく「受動ポンピング」など）または流量制御デバイス（灌流システムなど）を使用して、必要に応じて培地を供給および除去するための制御システム[5] [6] [7] [1] [8]
すべてのポリマーが生体適合性があるわけではないため、製造材料は非常に重要です。PDMSなどの一部の材料は、小分子の望ましくない吸着や吸収を引き起こします。 [9] [10]さらに、未硬化のPDMSオリゴマーは細胞培養培地に浸出する可能性があり、微小環境に悪影響を与える可能性があります。[9]一般的に使用されているPDMSの代替として、代替材料として熱可塑性プラスチック（例：ポリスチレン）の使用が進歩しています。 [11] [12]
マイクロスケールデバイスにおける細胞の空間的構成は、細胞が生体内で機能を果たすための培養領域の形状に大きく依存する。[13] [14]たとえば、ニューロンを培養するには、長くて狭いチャネルが望ましい場合がある。[13]選択された灌流システムも、選択された形状に影響を与える可能性がある。たとえば、シリンジポンプを組み込んだシステムでは、細胞培養を維持するために、灌流入口、灌流出口、廃棄物、および細胞ローディング用のチャネルを追加する必要がある。[15]マイクロ流体細胞培養における灌流は、チップ上での長い培養期間と細胞分化を可能にするために重要である。[16]
微小環境を制御するための他の重要な側面としては、細胞播種密度、細胞膜を破壊する可能性のある気泡の減少、湿度の不十分な環境による培地の蒸発、細胞培養の維持（定期的かつタイムリーな培地交換）などが挙げられる。[17] [16] [18]
細胞の健康は、必須かつ特殊な細胞プロセスの集合的な平衡活動として定義され、一方、細胞ストレッサーは、平衡状態からの逸脱を引き起こす刺激として定義されます。したがって、プラットフォームの設計や動作条件に基づいて、マイクロシステム内で細胞の健康が乱れる可能性があります。マイクロシステム内でのストレッサーへの曝露は、直接的および間接的な方法で細胞に影響を与える可能性があります。したがって、細胞培養用のマイクロ流体システムを設計する際には、細胞ストレス状況を最小限に抑えることが重要です。たとえば、細胞懸濁液を最小限に抑える、急激な形状を避ける（気泡形成を促進する傾向がある）、より高く広いチャネルを設計する（せん断応力を避けるため）、または熱に敏感なハイドロゲルを避けるなどです。[19]
利点
マイクロ流体細胞培養の主な利点としては、サンプル量の削減（多くの場合限られている初代培養細胞を使用する場合に特に重要）や、同じデバイス内で複数の微小環境をカスタマイズして研究できる柔軟性などが挙げられます。[3]また、マクロスケールの培養システム（多くの場合10 5～ 10 7 個の細胞が必要）と比較して、マイクロスケールのシステム（数百個の細胞）では細胞数を減らすこともできます。これにより、特定の細胞間相互作用の研究が容易になります。[10]細胞数が減ると、サンプル量が少なくなるため、分裂しない細胞や分裂が遅い細胞（幹細胞など）の研究が従来の培養方法（フラスコ、ペトリ皿、ウェルプレートなど）よりも容易になります。[10] [20]マイクロ流体の寸法が小さいため、層流を実現でき、他の培養チャンバーに影響を与えることなく培養システムを簡単に操作できます。[20]層流は生体内の流体力学をより正確に模倣するため有用であり、多くの場合、従来の培養方法よりもマイクロスケール培養の方が適切である。 [21]区画化されたマイクロ流体培養は、生細胞カルシウムイメージングとも組み合わせられており、脱分極刺激がニューロンの末梢末端に送達され、カルシウム応答が細胞体に記録されている。[22]この技術は、プロトンなどの特定の刺激に対する末梢末端の感度とニューロン細胞体の感度に著しい違いがあることを実証している。[22]これは、マイクロ流体細胞培養デバイスを使用して末梢末端を単独で研究することがなぜそれほど重要であるかを示す優れた例である。
文化プラットフォーム
伝統的な細胞培養
従来の2次元（2D）細胞培養は、ウェルプレートの底などの平らな表面で行われる細胞培養であり、従来法として知られています。[1]これらのプラットフォームは、後続の実験で使用する細胞を増殖および継代するには便利ですが、細胞が自由に移動したり、細胞外マトリックス材料の相互作用に依存する生体内で観察される機能を実行したりできないため、刺激に対する細胞の反応をモニタリングするための理想的な環境ではありません。 [1]この問題に対処するために、3次元（3D）ネイティブ細胞環境を作成するための多くの方法が開発されてきました。 3D方法の1つの例はハンギングドロップです。これは、増殖中の細胞を含む液滴が吊り下げられて下向きに垂れ下がり、これにより細胞が互いの周囲や上に成長して、回転楕円体を形成します。[23]ハンギングドロップ法は腫瘍細胞の培養に使用されていますが、球形の形状に限定されています。[24]ソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスの製造の登場以来[25]、マイクロ流体デバイスは進歩し、細胞培養のための自然な3D環境を模倣するのに非常に有益であることが証明されています。[26]
マイクロ流体細胞培養
マイクロ流体デバイスは、3D 環境で単一細胞から数百個の細胞までを研究することを可能にします。比較すると、マクロな 2D 培養では、平らな表面に10 4から 10 7 個の細胞があります。 [10]マイクロ流体では、化学勾配、新鮮な培地の連続フロー、ハイスループット テスト、分析機器への直接出力も可能になります。[10]さらに、「マイクロカナル」などのオープン マイクロ流体細胞培養では、マイクロピペットで細胞を直接物理的に操作できます。 [27]多くのマイクロ流体システムでは、繊維の厚さと孔のサイズを調整できるハイドロゲルを細胞外マトリックス(ECM) サポートとして使用しており、がん細胞の増殖を可能にすることが実証されています。[28]ゲルを使用しない 3D 細胞培養は、細胞が密な環境でも ECM の少ない環境でも増殖できるように開発されました。[29]これらのデバイスは非常に有用であることが証明されているが、細胞がPDMS表面に付着したり、小分子がPDMSに拡散したり、未反応のPDMSポリマーが細胞培養培地に流れ込んだりするなどの欠点もある。[10]
マイクロ流体デバイスでの3D 細胞培養の使用により、臓器オンチップと呼ばれる研究分野が生まれました。このタイプのマイクロ流体培養の最初の報告は、ナフタレン代謝物の肝臓と肺への毒性を研究するために使用されました (Viravaidya ら)。これらのデバイスは、多くの生物学的プロセスを理解するために使用できる臓器のようなシステムの簡素化されたバージョンを成長させることができます。[1]次元を追加することで、より高度な細胞構造を実現でき、細胞の挙動は生体内のダイナミクスをより代表的になります。細胞は近隣の細胞との強化されたコミュニケーションに従事し、細胞と細胞外マトリックスの相互作用をモデル化できます。[1] [30]これらのデバイスでは、さまざまなチャネルが細胞に栄養素を送達しながら、異なる細胞タイプを含むチャンバーまたはコラーゲン層が数日間相互作用することができます。[1] [31]これらのデバイスの利点は、組織の機能を制御された条件下（例えば、せん断応力の細胞への影響、周期的ひずみまたはその他の力の影響）で特徴付け、観察して、臓器の全体的な機能をよりよく理解できることです。[1] [32]これらの3Dモデルは、2Dモデルと比較して細胞レベルでの臓器機能のモデル化に優れていますが、課題も残っています。課題には、細胞の画像化、静的モデル（灌流システムなし）での勾配の制御、血管の再現の難しさなどがあります。[32]これらの課題にもかかわらず、3Dモデルは薬理学研究で薬物反応を研究およびテストするためのツールとして今でも使用されています。 [1]近年、複雑な生体内微小血管ネットワークを再現するマイクロ流体デバイスがあります。 臓器チップは、露出した気道内の肺上皮細胞などの非常に複雑なシステムを複製するためにも使用されており、多細胞システムと組織が生体内でどのように機能するかについて貴重な洞察を提供しています。[33] これらのデバイスは生理学的にリアルな3D環境を作り出すことができ、薬物スクリーニング、薬物送達、細胞間相互作用、腫瘍転移などのツールとして望ましい。[34] [35]ある研究では、研究者は腫瘍細胞を培養し、シスプラチン、レスベラトロール、チラパザミン（TPZ）の薬物送達をテストし、その後、薬物が細胞生存率に与える影響を測定した。[36]
マイクロ流体システムにおける細胞の応用
マイクロ流体システムは、さまざまな種類の細胞を培養するために使用できます。
哺乳類細胞の培養
哺乳類細胞培養は、マクロスケールのデジタルマイクロ流体（DMF）デバイスによって、播種、数週間培養、剥離、新鮮な培養培地への 継代を繰り返すことができる。 [37]
非哺乳類細胞の培養
藻類
藻類は培養することができ、その成長率と脂質生産はハンギングドロップマイクロ流体システムで監視することができます。例えば、ミシュラらは25x75 mmのアクセスしやすいマイクロ流体デバイスを開発しました。この設計は、ウェルの直径、紫外線照射（突然変異誘発を引き起こす）、光/無光テストを変更することで条件を最適化するために使用され、バイオ燃料生産のための最も一般的な淡水微細藻類の1つであるボツリオコッカス・ブラウニを培養します。[38]
細菌と酵母
マイクロ流体システムは、大量の細菌や酵母の コロニーを培養するために使用できます。[39] 2層マイクロケモスタットデバイスは、科学者が細胞を動かしたり細胞間相互作用を引き起こしたりすることなく、化学定常および温度定常条件下で細胞を培養できるようにするために作られています。 [39]酵母細胞懸濁液の液滴は、パターン化された親水性領域を持つプレート上に置かれ、24時間培養されます。その後、液滴を分割し、酵母から生成されたタンパク質を、元の液滴内の細胞を殺すことなくMALDI-MSで分析します。[40]
マイクロ流体におけるマルチカルチャー
生体内の非常に複雑な微小環境と比較すると、従来のin vitroでの単一細胞タイプの単一培養では、他の細胞タイプとの相互作用がないため、細胞の挙動に関する情報は限られています。通常、細胞間シグナル伝達は、距離に応じて、内分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達、自己分泌シグナル伝達、および近傍分泌シグナル伝達の4つのカテゴリに分類できます。[41]たとえば、傍分泌シグナル伝達では、1つの細胞から分泌された成長因子が短い距離を拡散して隣接する標的細胞に移動しますが、[42]近傍分泌シグナル伝達では、1つの細胞の膜結合リガンドが隣接細胞の表面受容体に直接結合します。[43] in vitro細胞培養に細胞シグナル伝達を組み込むための従来のアプローチには、馴化培地の移送、混合（または直接）共培養、および分離（または間接）共培養の3つがあります。[44]ある細胞タイプ（エフェクター）の培養培地を別の細胞タイプ（レスポンダー）の培養液に導入する馴化培地の使用は、細胞シグナル伝達に可溶性因子の効果を含めるための従来の方法です。[45]しかし、この方法では一方向のシグナル伝達しかできず、短寿命因子（レスポンダー細胞培養に移される前に分解されることが多い）には適用されず、分泌因子の一時的な観察もできません。[46]最近、共培養は、生物学的に関連する2つの細胞タイプを一緒に培養することにより、細胞コミュニケーションの効果を研究するための主流のアプローチになっています。混合共培養は最も単純な共培養法であり、2つのタイプの細胞が単一の培養区画内で所望の細胞比で直接接触します。[47]細胞はパラクリンおよびジャクスタクリンシグナル伝達によってコミュニケーションできますが、完全に混合された細胞集団のため、単一細胞タイプの別々の処理や下流の分析は容易に実行できません。[48] [49]より一般的な方法は、2種類の細胞が物理的に分離されているが、パラクリンシグナル伝達によって共有培地で通信できる分離共培養である。物理的障壁は、多孔質膜、固体壁、またはハイドロゲル仕切りである。[48] [49] [50] [51] [52] [53]物理的障壁が除去可能な場合（PDMSやハイドロゲルなど）、このアッセイは細胞侵入や細胞移動の研究にも使用できる。[49] [52]共培養設計は、多くの場合、 in vivoでのより代表的な3培養または多重培養に適応することができる。共培養に関連する条件。[49] [50] [54] [55]
閉鎖チャネル多培養システム
マイクロ流体デバイスの柔軟性は、空間パターンの制御を改善することで、多培養研究の発展に大きく貢献します。PDMSは伝統的にラピッドプロトタイピングを可能にしてきたため、PDMS製の閉チャネルシステムが最も一般的に使用されています。たとえば、液滴ベースのマイクロ流体では、共カプセル化システムによって混合共培養を簡単に実現し、傍分泌および近傍分泌シグナル伝達を研究できます。[56]細胞を含んだアガロース溶液の2つの流れを組み合わせることで、2種類の細胞が液滴に共カプセル化されます。ゲル化後、アガロースマイクロゲルは細胞共培養のための3Dマイクロ環境として機能します。[56]マイクロ流体チャネルでは、傍分泌シグナル伝達を研究するための分離共培養も実現されています。ヒト肺胞上 皮細胞と微小血管内皮細胞は、薄くて多孔性で伸縮性のあるPDMS膜で区切られた区画化されたPDMSチャネルで共培養することができ、肺胞毛細血管バリアを模倣する。[51]内皮細胞は、3Dコラーゲン足場で分離された状態で単層で癌細胞と共培養し、内皮細胞の移動と毛細血管の成長を研究することもできる。 [57]唾液腺腺様嚢胞癌（ACC）細胞は、ゲルに埋め込まれると、3D細胞外マトリックスで癌関連線維芽細胞（CAF）と共培養し、3D環境での間質制御癌浸潤を研究することができる。[58]傍分泌シグナル伝達なしでジャクスタクリンシグナル伝達のみを調査する場合は、細胞弁原理に基づいて単一細胞結合共培養マイクロ流体アレイを設計することができる。[59]
オープンチャネル多文化システム
クローズドチャネルマイクロ流体（上のセクションで説明）は、マルチカルチャーに高いカスタマイズ性と生物学的複雑性を提供しますが、操作には多くの場合、取り扱いの専門知識と、ポンプやバルブなどの特殊な機器が必要です。[49] [53]さらに、PDMSの使用は、オリゴマーの浸出や小分子の吸収など、細胞培養に悪影響を及ぼすことが知られており、生物学者から疑問視されることがよくあります。[60]そのため、確立された細胞培養材料であるポリスチレン（PS）で作られたオープンマイクロ流体デバイスが登場し始めました。 [60]オープンマルチカルチャー設計の利点は、ピペットで直接アクセスでき、製造が簡単（マイクロミリング、3Dプリント、射出成形、またはカミソリ印刷–後続の接着ステップやチャネルクリアランス技術は不要）です。[49] [53] [61] [62] [63]これらは、マルチカルチャー実験の複雑さを残したまま、従来の培養容器（ウェルプレートまたはペトリ皿）に組み込むこともできます。[49] [53] [62] [63]例えば、自発的な毛細管流を介してレールに沿ってハイドロゲル壁をパターン化する「モノレールデバイス」は、市販の24ウェルプレートに挿入できます。[62]柔軟なパターン形成形状は、3Dプリントまたはミリングされたインサートを変更するだけで実現できます。 モノレールデバイスは、微生物細胞と哺乳類細胞で異なる培地と培養要件があるため、従来の共有培地共培養では難しい多界可溶性因子シグナル伝達の研究にも適応できます。[62]レイザープリントで製造された別のオープンマルチカルチャーデバイスは、2D、3D、トランスウェル、スフェロイド培養など、多数の培養様式を統合できます。[49]また、可溶性因子のパラクリンシグナル伝達を促進するために拡散が改善されていることも示されています。[49]
細胞微小環境の制御
マイクロ流体システムは、従来の培養システムで可能な範囲を超えて、局所的な細胞微小環境を制御する能力を拡大します。さまざまな環境を安定的かつ持続的かつ正確に提供できることは、細胞培養の研究と調査に大きな影響を与えます。これらの環境要因には、物理的（せん断応力）、生化学的（細胞間相互作用、細胞分子相互作用、細胞基質相互作用）、および物理化学的（pH、 CO 2、温度、 O 2）要因が含まれます。 [64]
酸素濃度制御
酸素は生物系において重要な役割を果たしている。[65]酸素濃度の制御は、好気性種であろうと、ベースライン代謝や機能など生体内の細胞機能を調整する場合であろうと、マイクロ流体システムを設計する際の重要な要素の1つである。 [65]細胞培養に必要なガス濃度を制御するために、複数のマイクロ流体システムが設計されている。例えば、酸素勾配の生成は、ガスボンベや酸素除去剤を使用せずに、チャネル内の単層PDMS構造（厚さ50 μm未満、25 °CでのネイティブPDMSの酸素の拡散係数、D = 3.55x10 −5 cm 2 s −1）によって達成された。そのため、マイクロ流体細胞培養デバイスをインキュベーター内に配置して簡単に操作することができる。[66]しかし、PDMSは小さな疎水性種の吸着に問題がある可能性がある。[67]ポリメチルペンテン（PMP）はPDMSと同様に高い酸素透過性と生体適合性を備えているため、代替材料となる可能性がある。[68] [69]ガス濃度を制御するという課題に加えて、マイクロ流体システム内の酸素を監視することも取り組むべき課題である。システム内の酸素を消費することなく、酸素による発光消光現象に基づいた光学的発光ベースの酸素センシングとして使用できるさまざまな色素指示薬が多数ある。[ 70]この技術により、マイクロスケール環境での酸素の監視が可能になり、生物学研究室に適用できる。[70]
温度制御
温度は細胞によって感知され、生化学反応速度論などの細胞の挙動に影響を与える。[71]しかし、従来の細胞培養システムでは高解像度の温度を制御することは困難である。一方、マイクロ流体システムは、いくつかの技術により、さまざまな温度条件下で目的の温度にうまく到達できることが証明されている。[71]たとえば、マイクロ流体システム内の温度勾配は、異なる温度と流量で2つ以上の入力を混合することによって実現でき、温度はポリマーベースの水槽熱電対を埋め込むことによって出口チャネルで測定される。[72]また、マイクロ流体システムのベースにヒーターとデジタル温度センサーを設置することで、マイクロ流体細胞培養システムが少なくとも500時間連続して動作できることが実証されている。[73]マイクロ流体システム内の循環水チャネルは、細胞培養チャネルとチャンバーの温度を正確に制御するためにも使用される。 [39]さらに、デバイスを細胞培養インキュベーター内に配置すると、細胞培養温度を簡単に制御することもできる。[74]
参照
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