ケモスタット

ケモスタット
流入（供給）と流出（排出）を示すケモスタット図。
業界	生物工学
応用	研究と産業

ケモスタット（化学的環境が静的であることから）は、新鮮な培地が継続的に追加され、残った栄養素、代謝最終産物、微生物を含む培養液が同じ速度で継続的に除去され、培養容積が一定に保たれるバイオリアクターです。[ ^{2] [3]}培地をバイオリアクターに追加する速度を変更することで、微生物の特定の成長速度を制限内で簡単に制御できます。

ケモスタットの最も重要な特徴の 1 つは、一定の環境条件下で微生物を生理学的定常状態で増殖できることです。この定常状態では、一定の比増殖速度で増殖し、すべての培養パラメータ (培養量、溶存酸素濃度、栄養素と生成物の濃度、pH、細胞密度など) は一定のままです。さらに、環境条件は実験者が制御できます。^[4]ケモスタットで増殖する微生物は、増殖速度と栄養素の消費量の間に負のフィードバックがあるため、通常は定常状態に達します。バイオリアクター内に存在する細胞数が少ない場合、細胞は栄養素をほとんど消費しないため、希釈率よりも高い増殖速度で増殖することができ、流入する新鮮な培地とともに制限栄養素を追加しても増殖があまり制限されません。制限栄養素は増殖に不可欠な栄養素であり、培地中に制限濃度で存在します (他のすべての栄養素は通常、余剰で供給されます)。しかし、細胞数が多くなるほど、消費される栄養素が多くなり、制限栄養素の濃度が低下します。その結果、細胞の比増殖速度が低下し、流出によってシステムから細胞が除去され続けるため、細胞数が減少します。その結果、定常状態になります。自己調節により、定常状態は安定しています。これにより、実験者は、容器に新鮮な培地を供給するポンプの速度を変更することで、微生物の比増殖速度を制御できます。

ケモスタットやその他の連続培養システムのもう一つの重要な特徴は、それらがよく混合されているため、環境条件が均質または均一であり、微生物がランダムに分散し、ランダムに互いに遭遇することです。したがって、ケモスタット内の競争やその他の相互作用は、バイオフィルムとは対照的に、全体的です。

栄養素の交換率は希釈率 Dとして表されます。定常状態では、微生物の 特定の成長率 μ は希釈率Dに等しくなります。希釈率は、バイオリアクター内の培養 容積 Vに対する単位時間あたりの培地の流量Fとして定義されます。

${\displaystyle D={\frac {\text{培地流量}}{\text{培養容積}}}={\frac {F}{V}}}$

比成長率 μ は、バイオマスが倍増するのにかかる時間（倍増時間 t _{d ）}と反比例関係にあり、次の式で表されます。

${\displaystyle \mu ={\frac {\ln 2}{t_{d}}}}$

したがって、倍加時間t _dは定常状態では 希釈率Dの関数となる 。

${\displaystyle t_{d}={\frac {\ln 2}{D}}}$

特定の基質上で成長する各微生物には、最大比成長速度μ _max（成長が外部栄養素ではなく内部制約によって制限される場合に観察される成長速度）があります。μ _maxよりも高い希釈率を選択した場合、細胞は除去される速度と同じ速度で成長できないため、培養物はバイオリアクター内で維持できず、洗い流されてしまいます。

しかし、ケモスタット内の制限栄養素の濃度は供給物の濃度を超えることはできないため、ケモスタット内で細胞が到達できる比増殖速度は通常、最大比増殖速度よりもわずかに低くなります。これは、モノー方程式の速度論で説明されるように、比増殖速度は通常、栄養素の濃度とともに増加するためです。 ^[要出典]細胞が達成できる 最高の比増殖速度 ( μ _{max ) は、臨界希釈率 (} D' _c )に等しくなります。

${\displaystyle D=\mu _{\max}{S \over K_{S}+S},}$

ここで、Sはケモスタット内の基質または栄養素の濃度、K _{S は}半飽和定数です (この式ではモノー速度論を前提としています)。

研究用ケモスタットは、細胞生物学の研究に使用され、均一な細胞やタンパク質を大量に供給する源として利用されています。ケモスタットは、生物の代謝プロセスに関する数学モデルを作成するために、生物に関する定常状態のデータを収集するためによく使用されます。ケモスタットは、生態学^{[5] [6]}や進化生物学のミクロコスモスとしても使用されています。 ^{[7] [8] [9] [10]} 一方のケースでは、突然変異/選択は厄介なものです。もう一方のケースでは、突然変異/選択は研究中の望ましいプロセスです。ケモスタットは、栄養要求性細菌や抗生物質やバクテリオファージに耐性のある細菌の突然変異体など、培養中の特定の種類の細菌の突然変異体を濃縮して、さらなる科学的研究を行うためにも使用できます。[ 11 ]希釈率を変える^ことで、さまざまな成長速度で生物が追求する代謝戦略を研究できます。^{[12] [13]}

単一および複数の資源をめぐる競争、資源獲得と利用経路の進化、共生/交雑、^{[14] [15]}拮抗、捕食、捕食者間の競争はすべて、ケモスタットを用いた生態学と進化生物学で研究されてきました。^{[16] [17] [18]}

ケモスタットはエタノールの工業生産によく使用されます。この場合、複数のケモスタットが直列に使用され、それぞれが減少する糖濃度に維持されます。^[要出典]ケモスタットは、バイオテクノロジー産業における連続細胞培養の実験モデルとしても機能します。^[13]

• 泡が発生すると、液体の量が正確に一定ではなくなり、溢れが発生します。
• 非常に壊れやすい細胞は、撹拌と通気中に破裂することがあります。
• 細胞は壁上で増殖したり、他の表面に付着したりすることがあるが^[19]、これは容器のガラス壁をシランで処理して疎水性にすることで克服できる。しかし、壁に付着した細胞はシステムから除去されないため、壁に付着した細胞が選択される。壁​​にしっかりと付着してバイオフィルムを形成する細菌は、ケモスタット条件下で研究するのが難しい。
• 混合は実際には均一ではない可能性があり、ケモスタットの「静的」特性が乱れる可能性があります。
• 培地をチャンバー内に滴下すると、実際には栄養素の小さな脈動が生じ、濃度が変動し、再びケモスタットの「静的」特性が乱れます。
• 細菌は簡単に上流へ移動します。空気の遮断によって液体の経路が遮断され、培地が空気中に滴り落ちることがない限り、細菌はすぐに滅菌培地の貯蔵庫に到達します。

それぞれの欠陥を改善するための継続的な努力により、基本的なケモスタットにかなりの頻度でバリエーションが生まれます。文献には数多くの例が載っています。

• 消泡剤は泡立ちを抑えるために使われます。
• 撹拌と通気は穏やかに行うことができます。
• 壁の成長を抑えるために多くのアプローチが取られてきた^{[20] [21]}
• 様々な用途で、パドル、バブリング、またはその他の混合機構が使用されている^[22]
• 滴下は、液滴を小さくし、容器の容量を大きくすることで、それほど激しくなくすことができます。
• 多くの改善は汚染の脅威をターゲットにしている

^[23]

• ケモスタット内の制限基質の定常状態濃度は、流入濃度とは無関係です。流入濃度は細胞濃度に影​​響し、したがって定常状態 OD に影響します。
• ケモスタット内の限界基質濃度は通常非常に低く、個別の高濃度流入パルスによって維持されますが、実際にはケモスタット内の濃度の時間的変化は小さい (数パーセント以下) ため、準定常状態と見なすことができます。
• 細胞密度 (OD) が定常値 (オーバーシュート/アンダーシュート) に収束するまでの時間は、多くの場合長くなります (ケモスタットのターンオーバーが複数回必要)。特に初期接種量が多い場合はその傾向が顕著です。ただし、適切なパラメータを選択すれば、この時間を最小限に抑えることができます。

^[23]

• ケモスタットは定常状態にあるように見えますが、OD や生成物の濃度などのマクロスケールのパラメータを監視することでは検出できないにもかかわらず、突然変異株の乗っ取りが継続的に発生する可能性があります。
• 制限基質は通常、検出できないほど低い濃度です。その結果、異なる菌株が集団を乗っ取るにつれて、OD の変化が検出できないほど小さい場合でも、制限基質の濃度は時間の経過とともに（パーセンテージで）大きく変化する可能性があります。
• 「パルス」ケモスタット（非常に大きな流入パルスを使用）は、制限された条件で適応度が高まった変異株に対して、標準的な準連続ケモスタットよりも選択能力が大幅に低くなります。
• 流入を制限する基質濃度を急激に下げることで、ケモスタットが定常状態に戻るまで（希釈率 D の時間順で）、細胞を一時的に比較的厳しい条件にさらすことが可能です。

^[23]

• いくつかの種類の変異株は急速に出現します:
  • 適応度を高めることができるSNPがある場合、特徴的に大きなケモスタット (例: 10^11 E. coli細胞)の場合、わずか数回のケモスタット倍加後に集団に現れるはずです。
  • 2 つの特定の SNP を必要とし、その組み合わせによってのみ適応度の利点が得られる (一方、それぞれが個別には中立である) 株は、各 SNP のターゲット サイズ (有利な突然変異を生じる異なる SNP 位置の数) が非常に大きい場合にのみ出現する可能性があります。
• 他のタイプの変異株（たとえば、ターゲット サイズが小さい 2 つの SNP、より多くの SNP、またはより小さなケモスタット内）が出現する可能性は非常に低いです。
  • これらの他の突然変異は、適応度の利点を持つ突然変異体の連続的な一掃を通​​じてのみ予測されます。各突然変異が独立して有益な場合にのみ、複数の突然変異体の発生が予測されます。突然変異が個別には中立であっても、全体としては有益な場合は予測されません。連続的な乗っ取りは、ケモスタットで進化が進行するための唯一の確実な方法です。
• ケモスタット内ですべての SNP が少なくとも 1 回は共存する必要があるという一見極端なシナリオは、実際にはかなりあり得ます。大規模なケモスタットでは、この状態に達する可能性が非常に高くなります。
• 大型ケモスタットの場合、有利な突然変異が発生するまでの予想時間は、ケモスタットのターンオーバー時間と同程度です。通常、これは有利な菌株がケモスタットの集団を占領する時間よりも大幅に短いことに注意してください。小型ケモスタットでは必ずしもそうとは限りません。
• 上記の点は、無性生殖を行うさまざまな種（大腸菌、S. cerevisiaeなど）でも同じであると予想されます。
• さらに、突然変異が出現するまでの時間はゲノムサイズとは無関係ですが、BP あたりの突然変異率に依存します。
• 特徴的に大型のケモスタットの場合、高頻度変異株は使用に値するほどの利点をもたらしません。また、ランダムな突然変異によって常に出現し、ケモスタットを乗っ取ると予想されるほどの選択的利点もありません。

^[23]

• 関連するひずみパラメータを考慮すると、引き継ぎ時間は予測可能です。
• 希釈率を変えると、選択的に異なる変異株が優先され、ケモスタット集団を支配します（そのような株が存在する場合）。例:
  • 希釈率が速いと、最大成長率が上昇した変異株に対して選択圧が生じます。
  • 中程度の希釈率では、制限基質に対する親和性が高い変異株に対して選択圧が生じます。
  • 希釈率が遅いと、制限基質のない培地で増殖できる変異株に対する選択圧が生じます（おそらく培地中に存在する異なる基質を消費することによって）。
• 優れた突然変異体の引き継ぎ時間は、さまざまな操作パラメータにわたってほぼ一定です。特性操作値の場合、引き継ぎ時間は数日から数週間程度です。

^[23]

• 条件が適切であれば（個体数が十分に大きく、ゲノム内に単純な有利な突然変異の標的が複数ある）、複数の株が連続して個体群を乗っ取ることが予想され、そのタイミングとペースは比較的一定であると予想されます。タイミングは突然変異の種類によって異なります。
• テイクオーバー継承では、各株の選択的改善が一定のままであっても（たとえば、新しい株はそれぞれ、以前の株よりも一定の係数で優れている）、テイクオーバー率は一定のままではなく、株ごとに減少します。
• 連続した乗っ取りがあまりにも急速に起こるため、対立遺伝子頻度を調べても、株を区別することが非常に難しい場合があります。したがって、連続した株の複数の乗っ取りの系統は、突然変異のコホートを持つ単一の株の乗っ取りのように見える場合があります。

ケモスタットと密接に関連する発酵装置には、タービドスタット、オーキソスタット、リテントスタットがあります。リテントスタットでは、培養液もバイオリアクターから除去されますが、フィルターがバイオマスを保持します。この場合、バイオマス維持に必要な栄養素が消費可能な制限栄養素の量と等しくなるまで、バイオマス濃度が増加します。

• 細菌の増殖
• 生化学工学
• 変化統計
• 連続撹拌タンク反応器（CSTR）
• 大腸菌の長期進化実験
• フェドバッチ

1. http://www.pererikstormberg.se/examensarbete/chemostat.pdf
2. https://web.archive.org/web/20060504172359/http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/Contin/chemosta.htm
3. ケモスタットやその他のバイオリアクターの数学的モデルを含む最終論文
4. 実験室用ケモスタットの設計に関するページ
5. 包括的なケモスタットマニュアル (Dunham 研究室)。手順と原則は一般的なものです。