二次元核磁気共鳴分光法

最初にして最も一般的な2次元NMR実験は、互いに結合しているスピンを識別するために使用される同核相関分光法（COSY）シーケンスです。これは、単一のRFパルス（p1）に続いて特定の進化時間（t1）、続いて2番目のパルス（p2）、続いて測定期間（t2）で構成されます。^{[ 7 ]}

相関分光実験は、スカラー結合（ J結合とも呼ばれる）を介して互いに結合した原子核を相関させることによって機能します。^{[ 8 ]}この結合は、結合によって接続された核スピン間の相互作用であり、通常、2～3個の結合で離れた原子核間（例えば、隣接するプロトン間）で観測されます。これらの相互作用を検出することにより、COSYは分子内の原子間の接続性に関する重要な情報を提供し、有機化学における構造解明のための重要なツールとなっています。

COSY実験では、x軸（水平）とy軸（垂直）に沿って化学シフトを持つ2次元スペクトルが生成され、いくつかの重要なステップが含まれます。 ^{[ 1 ]}まず、一連の無線周波数（RF）パルスを使用してサンプルを励起し、核スピンをより高いエネルギー状態にします。最初のRFパルスの後、システムは_t1と呼ばれる期間自由に進化し、その間、スピンは化学シフトに対応する周波数で歳差運動します。間接的な相互作用を捉えるために進化時間（ _t1 ）を段階的に変化させることで、核間の相関が実現されます。t1の値がそれぞれ異なるこの一連の実験により、₁次元スペクトルでは直接観測できない可能性のある核からの化学シフトを検出できます。t1が増加すると_、結果として得られる2Dスペクトルにクロスピークが生成され、核間の結合や空間的近接などの相互作用を表します。この手法は原子間の結合をマッピングするのに役立ち、分子構造へのより深い洞察を提供し、複雑なシステムの解釈を支援する。

クロスピークは磁化移動と呼ばれる現象によって生じ、その存在は、クロスピークの座標を構成する2つの異なる化学シフトを持つ2つの原子核が結合していることを示しています。各結合により、対角線の上と下に2つの対称的なクロスピークが生じます。つまり、これらの値でスペクトルの信号が2つの軸に沿って相関している場合にクロスピークが発生します。クロスピークがどの結合を表しているかを簡単に視覚的に判断する方法は、クロスピークの真上または真下にある対角線ピークと、クロスピークの真左または真右にあるもう一方の対角線ピークを見つけることです。これら2つの対角線ピークで表される原子核は結合しています。^{[ 7 ]}

次に、結合した原子核間で磁化を移動させるために、2回目のRFパルスが印加されます。得られた信号は、2回目のRFパルス印加後の検出期間（ _t2）中に連続的に記録されます。その後、データはt1軸とt2軸の両方に沿ってフーリエ変換によって処理され_、対角線_と非対角線に沿ってピークがプロットされた2次元スペクトルが作成されます。

COSYスペクトルを解釈する際、対角ピークは個々の原子核の1次元化学シフトに対応し、1次元NMRスペクトルの標準ピークと同様です。COSYスペクトルの重要な特徴は、図1に示すように、原子核間のカップリングを示すクロスピークが存在することです。これらのクロスピークは、分子内の結合に関する重要な情報を提供し、2つの原子核が少数の結合（通常は2つまたは3つの結合）で接続されていることを示します。

COSYは、天然物、ペプチド、タンパク質などの複雑な分子を扱う際に特に有用です。これらの分子では、結合を介した異なる原子核間のつながりを理解することが不可欠です。1D NMRはより簡便で基本的な構造的特徴を特定するのに理想的ですが、COSYは分子のつながりに関するより深い洞察を提供することで、NMRの能力を向上させます。

COSY実験から得られる二次元スペクトルは、両軸に沿って単一の同位体（最も一般的には水素（^{1H ））の周波数を示します。（ 13C}や^1Hなど、2つの軸が異なる同位体に対応する異核相関スペクトルを生成する技術も考案されています。）対角ピークは1D-NMR実験のピークに対応し、クロスピークは核ペア間のカップリングを示します（多重線分裂が1D-NMRにおけるカップリングを示すのと同様です）。^{[ 7 ]}

COSY-90 は最も一般的な COSY 実験です。 COSY-90 では、p1 パルスによって核スピンが 90° 傾きます。 COSY ファミリーのもう 1 つのメンバーはCOSY-45です。 COSY-45 では、2 番目のパルス p2 に 90° パルスの代わりに 45° パルスが使用されます。 COSY-45 の利点は、対角ピークが目立たないため、大きな分子の対角付近のクロスピークを合わせやすくなることです。 さらに、COSY-45 スペクトルから、カップリング定数の相対的な符号 ( J カップリング#J カップリングの大きさを参照) を明らかにすることができます。これは COSY-90 では不可能です。^{[ 9 ]} 全体として、COSY-45 はよりクリーンなスペクトルを提供し、COSY-90 はより感度が高いです。

関連する別の COSY 技術として、二重量子フィルター (DQF) COSY があります。DQF COSY は、位相サイクリングやパルス磁場勾配などのコヒーレンス選択法を使用し、二重量子コヒーレンスからの信号のみが観測可能な信号となるようにします。これにより、対角ピークの強度が低下し、その線形が広い「分散」線形からより鋭い「吸収」線形に変化します。また、非結合核からの対角ピークも除去されます。これらの利点はすべて、通常の COSY スペクトルでは弱いクロスピークが対角ピークによって隠されるのを防ぎ、よりクリーンなスペクトルが得られることです。^{[ 10 ]}

TOCSY実験は、結合したプロトンのクロスピークが観測されるという点でCOSY実験と似ています。ただし、クロスピークは直接結合している核だけでなく、結合の連鎖でつながっている核間でも観測されます。このため、より大きな相互接続されたスピン結合ネットワークを識別するのに役立ちます。この機能は、混合期間中に等方混合を引き起こす一連のパルスを繰り返し挿入することによって実現されます。等方混合時間が長くなると、偏極がより多くの結合に広がります。^{[ 11 ]}

オリゴ糖の場合、各糖残基は独立したスピン系であるため、特定の糖残基のすべてのプロトンを区別することが可能です。TOCSYの1次元バージョンも利用可能で、単一のプロトンに照射することで、残りのスピン系を明らかにすることができます。この技術の最近の進歩には、より高品質のスペクトルが得られ、カップリング定数を確実に抽出して立体化学の決定に役立てることができる1次元CSSF（化学シフト選択フィルター）TOCSY実験が含まれます。

TOCSYは「同核ハルトマン・ハーン分光法」（HOHAHA）と呼ばれることもある。^{[ 12 ]}

INADEQUATE ^{[ 13 ]}は、隣接する炭素原子間の¹³ C カップリングを見つけるためによく使用される方法です^。13 Cの天然存在比は約 1% しかないため、この実験で信号を得るために必要な 2 つの近接する¹³ C 原子を持つ分子は、研究対象の分子の約 0.01% しかありません。しかし、相関選択法 (DQF COSY と同様) を使用して単一の¹³ C 原子からの信号を排除し、二重¹³ C 信号を容易に分離できるようにします。結合した核の各ペアは、INADEQUATE スペクトル上に同じ垂直座標 (核の化学シフトの合計) を持つ一対のピークを与え、各ピークの水平座標は、それぞれの核の化学シフトです。^{[ 14 ]}

^{異核単量子コヒーレンス（HSQC）は、1つの結合で隔てられた異なる種類の原子核、特にプロトン（ 1H}）と炭素（13C）や窒素（15N）などの^異核^との間の相互作用を検出するために使用される2D NMR技術です。^{[ 17 ]}この方法では、結合した原子核のペアごとに1つのピークが得られ、その2つの座標は、結合した2つの原子の化学シフトです。^{[ 18 ]}

この手法は、構造解析、特に有機化合物、天然物、タンパク質や核酸などの生体分子の分析において重要な役割を果たします。HSQCは、プロトンと異核原子間の1結合相関を検出するように設計されており、磁化の移動を通して水素と異核原子の結合状態に関する知見を提供します。

HSQC実験では、2次元NMRスペクトルを生成するために一連の手順が行われます。まず、試料に高周波（RF）パルスを照射して励起し、核スピンを励起状態にして磁化移動の準備をします。次に、1結合スカラー結合（J結合）を介してプロトンから異種核へ磁化を移動させ、直接結合した核のみが移動に関与するようにします。その後、システムはt1と呼ばれる期間にわたって変化し_、異種核からプロトンへ磁化が逆方向に移動します。最終的に、プロトンと異種核の両方の情報が符号化された信号が検出され、フーリエ変換を実行してプロトンと異種核の化学シフトを相関させた2次元スペクトルを作成します。

HSQCは、 INEPTパルスシーケンスを使用してI原子核（通常はプロトン）からS原子核（通常はヘテロ原子）へ磁化を移動させることで機能します。この最初のステップは、プロトンの平衡磁化が大きいため、このステップでより強い信号が生成されるため行われます。その後、磁化は進化し、観測のためにI原子核に戻されます。オプションで追加のスピンエコーステップを使用して信号を分離し、多重線を単一のピークに縮退させることでスペクトルを単純化できます。不要な非結合信号は、特定のパルスの位相を反転させて実験を2回実行することで除去されます。これにより、目的のピークの符号は反転しますが、不要なピークの符号は反転しないため、2つのスペクトルを差し引くと目的のピークのみが得られます。^{[ 18 ]}

HSQC スペクトルの解釈は、プロトンと炭素または窒素との直接結合を示すクロスピークの観測に基づいています。各クロスピークは特定の¹ H- ¹³ C または¹ H- ¹⁵ N ペアに対応し、X がヘテロ核である 1H-X 連結性の直接割り当てを提供します^{[ 17 ]} HSQC 技術には、1 結合相関に焦点を当てていること、プロトンの直接検出による感度の向上、重なり合う信号を分離して複雑な分子の分析を支援することによって混雑したスペクトルを単純化することなど、いくつかの利点があります。

異核多量子相関分光法（HMQC）はHSQCと同一のスペクトルを与えるが、異なる方法を用いる。両方法は小～中サイズの分子に対しては同様の品質の結果を与えるが、HSQCはより大きな分子に対して優れていると考えられている。^{[ 18 ]}

HMBCは、約2 ～ 4結合のより長い範囲にわたる異核相関を検出します。多重結合相関の検出が難しいのは、HSQCおよびHMQCシーケンスにはパルス間の特定の遅延時間が含まれており、特定のカップリング定数付近の範囲しか検出できないためです。これは、カップリング定数が狭い範囲にある傾向があるため、単結合法では問題になりませんが、多重結合カップリング定数ははるかに広い範囲をカバーするため、単一のHSQCまたはHMQC実験ですべてを捉えることはできません。^{[ 19 ]}

HMBCでは、HMQCシーケンスからこれらの遅延の1つを省略することでこの問題を克服します。これにより、検出可能なカップリング定数の範囲が広がり、緩和による信号損失も減少します。ただし、この方法ではスペクトルのデカップリングが不可能になり、信号に位相歪みが生じます。HMBC法には、1結合信号を抑制して多重結合信号のみを残す修正法があります。^{[ 19 ]}

NOESYでは、混合期間中の核スピン間の核オーバーハウザー交差緩和を利用して相関を確立します。得られるスペクトルは、対角ピークとクロスピークを持つCOSYに似ていますが、クロスピークは、結合を介して互いに結合している核ではなく、空間的に近い核からの共鳴を結びます。NOESYスペクトルには、追加の情報を提供しない余分な軸方向ピークも含まれており、最初のパルスの位相を反転させることで別の実験によって除去できます。^{[ 20 ]}

NOESYの応用例の一つは、タンパク質NMRなどの大型生体分子の研究であり、そこではシーケンシャルウォーキング法を用いて分子間の関係性を特定できることが多い。

NOESY実験は、個々の共鳴を事前に選択することで一次元的に実施することもできます。スペクトルは、事前に選択された原子核が大きな負の信号を示し、隣接する原子核はより弱い正の信号を示すように読み取られます。これにより、目的の共鳴に対して測定可能なNOEを持つピークのみが明らかになりますが、完全な2次元実験よりもはるかに短時間で済みます。さらに、事前に選択された原子核が実験の時間スケール内で環境を変化させた場合、複数の負の信号が観測される可能性があります。これは、EXSY（交換分光法）NMR法と同様の交換情報を提供します。

NOESY実験は溶媒中の分子の立体化学を特定するための重要なツールである一方、単結晶X線回折は固体状態の分子の立体化学を特定するために使用される。

HOESYでは、NOESYと同様に核スピン間の交差緩和に使用されます。ただし、HOESYは空間的に関連する方法で他のNMR活性核に関する情報を提供できます。例としては、¹ H→ ¹³ C、¹⁹ F→ ¹³ C、³¹ P→ ¹³ C、または⁷⁷ Se→ ^{13 Cなどの任意の核X{Y}またはX→Yが挙げられます。実験では通常、X、X{ 1} H}上のプロトンからのNOEが観測されますが、プロトンを含める必要はありません。^{[ 21 ]}

ROESYはNOESYと似ていますが、初期状態が異なります。z磁化の初期状態からの交差緩和を観測する代わりに、平衡磁化をx軸に回転させ、外部磁場によってスピンロックして歳差運動をさせないようにします。この方法は、回転相関時間が核オーバーハウザー効果が弱すぎて検出できない範囲にある特定の分子（通常は分子量が約1000ダルトンの分子）に有効です。これは、ROESYでは相関時間と交差緩和速度定数の間に異なる依存性があるためです。NOESYでは、相関時間が増加するにつれて交差緩和速度定数は正から負に変化し、ゼロに近い範囲になりますが、ROESYでは交差緩和速度定数は常に正です。^{[ 22 ] [ 23 ]}

ROESYは、「ロックされたスピンによって模倣されるミニ分子に適したクロス緩和」（CAMELSPIN）と呼ばれることもある。^{[ 23 ]}